Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina
Summary
Apresentamos um protocolo baseado em filtração para isolar núcleos de alta qualidade do músculo esquelético do mouse reticulado em que removemos a necessidade de ultracentrifugação, tornando-o facilmente aplicável. Mostramos que a cromatina preparada a partir dos núcleos é adequada para a imunoprecipitação com cromatina e prováveis estudos de sequenciação de imunoprecipitação com cromatina.
Abstract
A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) é um método poderoso para determinar a ligação da proteína ao DNA da cromatina. O músculo esquelético rico em fibra, no entanto, tem sido um desafio para ChIP devido a dificuldade técnica em isolamento de núcleos de alta qualidade com mínima contaminação de miofibrilas. Protocolos anteriores tentaram purificar núcleos antes da reticulação, o que incorre no risco de alteração da interação DNA-proteína durante o processo de preparação de núcleos prolongados. No protocolo atual, primeiro cruzamos o tecido do músculo esquelético coletado de camundongos e os tecidos foram picados e sonicados. Uma vez que descobrimos que a ultracentrifugação não foi capaz de separar núcleos de miofibrilos usando tecido muscular reticulado, elaboramos um procedimento de filtração seqüencial para obter núcleos de alta qualidade desprovidos de contaminação significativa por miofibrilas. Posteriormente, preparamos a cromatina usando um ultra-som, e os ensaios ChIP com anticorpo anti-BMAL1 revelaram uma ligação circadiana robustaPadrão de BMAL1 para direcionar os promotores de genes. Este protocolo de filtração constitui um método facilmente aplicável para isolar núcleos de alta qualidade do tecido do músculo esquelético reticulado, permitindo um processamento de amostra consistente para estudos circadianos e outros estudos sensíveis ao tempo. Em combinação com sequenciação de próxima geração (NGS), nosso método pode ser implantado para vários estudos mecanicistas e genômicos com foco na função do músculo esquelético.
Introduction
O músculo esquelético desempenha papéis importantes na fisiologia e no comportamento. A fibra muscular multi-nucleada consiste em miofibrilas onde a actina e a miosina formam unidades funcionais chamadas sarcomeres para gerar força contrátil. O músculo esquelético é também o maior órgão metabólico do corpo, representando> 80% de glicose pós-prandial e regulando a resposta da insulina e a homeostase metabólica 1 , 2 . A fisiologia muscular e o metabolismo são rigorosamente regulados pelo relógio circadiano, um temporizador biológico intrínseco 3 , 4 , 5 , 6 . Por exemplo, a deleção específica de músculo esquelético de Bmal1 , um dos componentes do relógio circadiano central, resultou em resistência à insulina e diminuição da captação de glicose no músculo esquelético, e os animais desenvolveram diabetes tipo 2 7 . EuAlém disso, o músculo esquelético também é cada vez mais apreciado como um órgão endócrino 8 , secretando as mioquinas para regular o metabolismo sistêmico e a fisiologia. Estudos mecânicos são necessários para entender completamente essas funções reguladoras no músculo esquelético.
O ChIP é uma abordagem poderosa para delinear o recrutamento do promotor de proteínas de ligação ao DNA. O ChIP foi inicialmente desenvolvido para identificar a organização dos nucleossomas no DNA da cromatina 9 , 10 . Desde então, uma variedade de métodos foram relatados para reticular proteínas e DNA de cromatina usando formaldeído, sulfato de dimetilo ou irradiação ultravioleta (UV) 11 , 12 . A reticulação do formaldeído é a mais utilizada, preservando a estrutura da cromatina e as interações DNA-proteína 9 , 13 , 14 . Cromatografia cruzadaIn é cortado por sonicação e imunoprecipitado com anticorpo contra a proteína de ligação de DNA particular 15 , 16 . Nos últimos anos, a sequenciação de ChIP (ChIP-seq), um método que combina ChIP com NGS, foi desenvolvido para interrogar a ligação ao fator de transcrição do genoma 17 e, em alguns casos, monitorar mudanças dinâmicas ao longo de um curso de tempo 18 , 19 , 20 . Por exemplo, os estudos circadianos de ChIP-seq revelaram uma sequência altamente orquestrada de ligação genômica de componentes do relógio circadiano e marcadores de histonas, o que impulsiona a expressão de genes temporalmente precisa ao longo do ciclo circadiano de aproximadamente 24 h 18 .
A maioria dos protocolos ChIP disponíveis são projetados para tecidos moles ( por exemplo , fígado, cérebro, etc. ), e muito poucos foram publicados para tecidos duros, incluindo esqueletoMuscular. É tecnicamente desafiador homogeneizar o músculo esquelético rico em fibras e isolar núcleos de alta qualidade 21 , especialmente para experiências ChIP que requerem reticulação. Em um recente estudo muscular ChIP 22 , as células satélites foram separadas das miofibras e os núcleos foram preparados a partir de ambos os tipos de células através de um procedimento prolongado envolvendo digestão tecidual. Todo o processo demorou aproximadamente três horas para completar antes que a reticulação de formaldeído fosse realizada em núcleos isolados. Embora este procedimento tenha evitado a fibra muscular de reticulação, o que torna o tecido muscular ainda mais refratário a uma homogeneização eficiente e foi capaz de produzir núcleos de alta qualidade, o tempo significativo de retirada de tecido para reticulação de núcleos incorre o risco de DNA alterado – interação protéica. Em contraste, a maioria dos estudos realizou reticulação imediatamente após o tratamento experimental ou a coleta de tecido para preservar o DNA-protei em tempo realN vinculativo 12 . Uma segunda desvantagem do isolamento de núcleos antes da reticulação é que ele impede aplicações sensíveis ao tempo, como a coleta de amostras circadianas, que normalmente ocorre em intervalos de 3 a 4 h. Sem reticular os núcleos, o isolamento precisa prosseguir imediatamente após a dissecção, enquanto que as amostras reticuladas podem ser processadas juntas após completar o curso inteiro, garantindo assim uma maior consistência experimental.
Outros protocolos para o isolamento de núcleos de músculo esquelético não reticulado também foram relatados. Dois estudos descreveram o uso de ultracentrifugação em gradiente para separar núcleos de miofibrilos e detritos celulares 23 , 24 . Enquanto a sacarose ou a ultracentrifugação de gradiente coloidal é eficaz com tecidos musculares não cruzados, nossas experiências revelaram que após a reticulação, a ultracentrifugação em gradiente não conseguiu separar os núcleos da célula dEbris no gradiente.
Por isso, desenvolvemos um procedimento para isolar núcleos de alta qualidade usando tecidos de músculo esquelético de rato reticulado. Ao invés de ultracentrifugação em gradiente, inventamos um método de filtração em série para separar separadamente núcleos de detritos. Após a ultra-sonografia, as amostras de cromatina foram aplicadas com sucesso para estudos de ChIP, que mostraram um padrão circadiano de ligação da proteína BMAL1 aos promotores alvo. Nosso método pode ser amplamente aplicável a vários estudos mecanicistas de tecidos musculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um método robusto onde os tecidos do músculo esquelético reticulado foram usados para isolar núcleos de alta qualidade. A filtração sequencial foi realizada para efetivamente separar os núcleos dos detritos, e a energia acústica ultra-sônica do transdutor em forma de prato cortou a cromatina para análise de ChIP. Os resultados mostraram a ligação circadiana específica do tempo de BMAL1 aos promotores alvo.
O ChIP pode ser empregado para capturar a ocupaç?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Karyn Esser, Nobuya Koike e Noheon Park por conselhos úteis. Este trabalho foi parcialmente suportado por NIH / NIGMS (R01GM114424) para S.-HY, e a Fundação Robert A. Welch (AU-1731) e NIH / NIA (R01AG045828) para ZC
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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