原位MHC-聚丙烯染色和定量分析确定抗原特异性 CD8 T 细胞在组织中的位置、丰度和表型
Summary
在这里, 我们描述一个方法, 结合原位MHC 聚丙烯染色与免疫组化, 以确定的定位, 表型和数量的抗原特异性 T 细胞在组织。本协议用于确定抗原特异性 CD8 T 细胞相对于其他细胞类型和组织结构的空间和表型特征。
Abstract
T 细胞对许多免疫过程至关重要, 包括检测和消除病毒感染的细胞, 预防自身免疫, 协助 B 细胞和血浆细胞产生抗体, 以及检测和消除癌细胞。流式细胞术分析抗原特异性 t 细胞 MHC-聚丙烯染色的进展, 改变了我们研究和理解 t 细胞免疫的能力。流式细胞仪在确定抗原特异性 t 细胞的数量和表型时非常有用, 但不能确定抗原特异性 t 细胞在组织中的其他细胞和结构的空间定位, 以及当前的分类技术提取流式细胞术所需的 T 细胞在非组织中的有效性有限。原位MHC-聚丙烯染色 (IST) 是一种技术的可视化 T 细胞是特定的抗原感兴趣的组织。结合免疫组化 (IHC), IST 可以确定抗原特异性 CD8 和 CD4 T 细胞在组织中的丰度、位置和表型。在这里, 我们描述一个协议, 以染色和列举抗原特异的 CD8 T 细胞, 与特定的表型位于特定的组织隔间。这些程序与我们在最近出版的李et al.中使用的相同, 标题是 “在卵泡中的猿猴免疫缺陷病毒产生细胞在体内被 CD8 的+细胞部分抑制.“所描述的方法是广泛适用的, 因为它们可以用于本地化, 表型, 并量化基本上任何抗原特异性 CD8 T 细胞的 MHC 体是可用的, 在任何组织。
Introduction
T 细胞对许多免疫过程至关重要, 包括检测和消除病毒感染的细胞, 预防自身免疫, 协助 B 细胞和血浆细胞产生抗体, 以及检测和消除癌细胞。多肽/MHC I. 类抗原特异性 CD8 t 细胞聚丙烯染色的研究进展1和最近发展的 mhc 类 II 聚丙烯染色 CD4 t 细胞2流式细胞术彻底改变了我们的学习和理解能力T 细胞的免疫。流式细胞仪在确定抗原特异性 t 细胞的数量和表型时非常有用, 但不允许检测抗原特异性 t 细胞在组织中的其他细胞和结构的空间定位, 以及当前用于提取流式细胞术所需 T 细胞的分类技术在非组织中的有效性有限3。
我们和其他人已经开发的方法使用肽负载 MHC i 类和 II 类聚丙烯或 multimer 试剂染色抗原特异性 CD8 和 CD4 T 细胞在组织中4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. 这些 IST 方法可以确定组织中抗原特异的 CD8 和 CD4 T 细胞的位置、丰度和表型, 并提供一种方法来检测这些细胞与组织中其他细胞和结构的关系。我们的小组广泛使用 MHC I 聚丙烯染色研究人体免疫缺陷病毒 (HIV) 和猴免疫缺陷病毒 (SIV) 特定的 CD8 T 细胞的淋巴, 生殖器和直肠组织获得了解艾滋病毒和 SIV 免疫并识别成功接种策略的相关性14,15,16,17。此外, 我们还开发了一种技术, 结合 IST 与原位杂交 (一), 以本地化和量化病毒特异性 CD8 T 细胞和病毒感染的细胞在组织和确定的在体内effector-to-target 水平18,19。
在这里, 我们描述了一个协议使用多肽负载 MHC I 体染色抗原特异性 CD8 T 细胞在新鲜的组织切片, counterstain 组织使用 IHC, 并量化细胞与特定的表型在特定的组织舱室。这些过程与我们最近出版的李et al.所使用的程序相同, 在该出版物中, 我们确定了在猕猴慢性 siv 感染过程中, 在淋巴组织中的 siv 特异性 T 细胞的位置、丰度和表型,20。
在这个过程中, 新鲜的组织被切片和培养过夜与肽负载 MHC I 体共轭的荧光素硫氰酸盐分子 (FITC)。然后固定在甲醛。在修复组织后, 从 MHC 体的信号被放大使用兔抗 FITC 抗体和孵化与荧光标记兔 IgG 抗体, 进一步放大信号从绑定体。IHC 与 IST 结合用于抗原特异 T 细胞和周围细胞的特征。抗体, 承认表位在细胞表面或在胞外空间是包括在初级孵化与体。识别细胞内抗原表位的抗体需要在染色前渗透细胞壁。使用共聚焦显微镜对染色组织切片进行成像, 并使用共焦软件进行分析。标记细胞使用共聚焦显微镜软件或 ImageJ 进行量化。所述的协议可用于在任何有 MHC I 体的组织中基本上染色任何抗原特异的 CD8 T 细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
IST 结合 IHC 提供了一个基本的工具, 以检测, 定性和量化抗原特异性 CD8 T 细胞在本机环境与其他细胞和组织结构的上下文。在这里, 我们描述了 IST 结合 IHC 的详细程序, 其次是定量图像分析, 以确定的位置, 丰度和表型的抗原特异性 CD8 T 细胞在淋巴结的恒河猴。类似的染色可以适用于人类, 老鼠, 或其他物种组织的 MHC I 体是可用的。此外, 肽 MHC 类 II 聚丙烯或 dextramer 染色可以使用相对相似的方法来?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) 的公共卫生服务补助金的支持。
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
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