Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz
Summary
Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.
Abstract
T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Akış Sitometresi tarafından analiz antijen spesifik T hücrelerinin MHC-tetramer boyama geliştirme çalışma ve T hücrelerinin immunobiology anlamak yeteneğimizi devrim yarattı. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi antijen spesifik T hücreler diğer hücrelere ve dokulara ve geçerli yükünün teknikleri yapıları kayma lokalizasyonu belirleyemiyor T ayıklamak için hücreleri için Akış Sitometresi etkinliği olmayan lenfoid dokulara sınırlı. Situ MHC-tetramer (IST) Boyama belirli antijenleri dokularda ilgi için T hücreleri görselleştirmek için bir tekniktir. İmmünhistokimya (IHC) ile birlikte, bereket, konumu ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında IST belirleyebilirsiniz. Burada, leke ve antijen spesifik CD8 T hücreleri, belirli doku bölmeleri içinde yer alan belirli fenotipleri ile numaralandırmak için bir protokol açıklayın. Bu işlemleri başlıklı Li vdtarafından bizim son yayında kullanılan aynıdır “köklerinin kısmen CD8 tarafından bastırılmış hücrelerde Simian immün yetmezlik virüsü üreten hücreleri+ In Vivo.” Çünkü onlar, fenotip, yerelleştirmek için kullanılan ve aslında herhangi bir antijen spesifik CD8 T hücre MHC tetramers herhangi bir doku elde edilebilir ölçmek açıklanan yöntemleri genel olarak geçerlidir.
Introduction
T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Geliştirme peptit/MHC sınıf ı antijen spesifik boyama CD8 T hücreleri1 ve MHC sınıf II tetramer CD4 T hücre2 / Akış Sitometresi tarafından boyama daha yeni geliştirme çalışması ve anlamak yeteneğimizi devrim tetramer immunobiology T hücrelerinin. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi diğer hücreleri ve yapıları dokularda ve geçerli antijen spesifik T hücrelerinin kayma yerelleştirme tespiti için izin vermez T hücreleri ayıklamak için yükünün teknikleri etkinliği olmayan lenfoid doku3Akış Sitometresi için sınırlı.
Biz ve diğerleri peptid yüklü MHC sınıf ı ve sınıf II tetramer veya multimer reaktifler antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücreleri doku4,5,6,7, leke yöntemleri kullanarak geliştirdik 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. bu IST yöntemleri konumunu, bereket ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında belirlenmesi için izin ve diğer hücre ve dokularda yapıları göreli bu hücrelerinin tespit etmek için bir yol sağlar. Bizim grup yoğun MHC kullanılan-ben insan immün yetmezlik virüsü (HIV) – ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) – çalışmaya boyama tetramer lenfoid, genital ve rektal dokularda HIV ve SIV immunopathogenesis anlamak için belirli CD8 T hücreleri ve başarılı stratejileri14,15,16,17ilişkilendirir tanımlamak için. Buna ek olarak, aynı zamanda IST in situ hibridizasyon (ISH yerelleştirilmesine ve virüs özgü CD8 T hücreleri ve hücre bulaştırmak virüs ölçmek için) ile birleştirir bir teknik dokularda ve in vivo efektör hedef düzeylerini belirlemek için geliştirdiğimiz 18 , 19.
Burada, MHC peptid yüklü bir iletişim kuralı’nı tarif-ben tetramers antijen spesifik CD8 T hücreleri, taze doku bölümlerde için counterstain doku IHC kullanarak leke ve belirli doku bölmeleri içinde belirli fenotipleri hücrelerle ölçmek için. Bu bizim son yayında Li hangi biz konumunu, bereket ve fenotip lenfoid doku SIV özgü T hücrelerinin makak20kronik SIV enfeksiyon sırasında tespit ve ark.tarafından kullanılan aynı yordamlardır.
Bu yordam için taze doku kesitli ve gecede peptid yüklü MHC ile inkübe-ben tetramers Birleşik floresein thiocyanate molekülleri (FITC). O zaman paraformaldehyde içinde sabitlenir. Doku düzelttikten sonra MHC tetramers sinyalini tavşan anti-FITC antikorları kullanarak ve daha fazla ilişkili tetramers sinyali yükseltmek fluorescently tagged Anti-tavşan IgG antikorlar ile inkübe güçlendirilmiş. IHC IST ile birlikte antijen spesifik T hücreleri ve çevreleyen hücreleri tanımlamak için kullanılır. Hücre veya hücre dışı alanda yüzeyinde epitopları tanımak antikorlar tetramers ile birincil kuluçka eklenir. Hücre içi epitopları tanımak antikor boyama önce hücre duvarı Permeasyon gerektirir. Lekeli doku bölümleri confocal bir mikroskop kullanarak yansıma ve confocal yazılım kullanılarak analiz. Etiketli hücreleri ImageJ veya confocal mikroskobu yazılım sayılabilir. Açıklanan protokol için hangi MHC antijen spesifik CD8 T hücre herhangi bir doku aslında herhangi bir leke için kullanılabilir-ben tetramers mevcuttur.
Protocol
Representative Results
Discussion
IHC ile kombine IST tespit, karakterize ve antijen spesifik CD8 T hücreleri diğer hücre ve doku yapıları bağlamı ile doğal ortamlarda miktarının için gerekli bir araç sağlar. Burada, biz fenotip antijen spesifik CD8 T hücrelerinin rhesus makak lenf düğümleri, bereket ve konumunu belirlemek için nicel görüntü analizi tarafından takip IHC ile birlikte IST için ayrıntılı yordamlar nitelendirdi. Benzer boyama uygulanan insan, fare veya diğer türler doku hangi MHC için olabilir-ben tetramers mevcu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından desteklenmiştir halk sağlığı hizmeti verir Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
