In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti
Summary
Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.
Abstract
Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l’autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo di MHC-tetramero macchiatura delle cellule T antigene-specifiche analizzate tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere l’immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non può determinare la localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e le attuali tecniche di disaggregazione per estrarre le T cellule necessarie per citometria a flusso hanno un’efficacia limitata in tessuti non linfoidi. In situ MHC-tetramero macchiatura (IST) è una tecnica per visualizzare le cellule T che sono specifiche per gli antigeni di interesse nei tessuti. In combinazione con immunohistochemistry (IHC), IST può determinare l’abbondanza, la posizione e il fenotipo delle cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per macchiare ed enumerare le cellule CD8 T antigene-specifiche, con specifici fenotipi che si trova all’interno di compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse che abbiamo usato nella nostra recente pubblicazione da Li et al., intitolato “cellule producenti su Virus dell’immunodeficienza delle scimmie in follicoli sono parzialmente soppresso da CD8+ cellule In Vivo.” I metodi descritti sono ampiamente applicabili perché può essere utilizzati per localizzare, fenotipo e quantificare essenzialmente qualsiasi cella di CD8 T antigene-specifiche per cui i tetrameri MHC sono disponibili, in tutto il tessuto.
Introduction
Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l’autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo del peptide/MHC di classe I tetramero macchiatura di antigene-specifiche le cellule CD8 T1 e il più recente sviluppo di MHC classe II tetramero macchiatura delle cellule di T CD42 tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere la immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non consente la rilevazione della localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e corrente tecniche di disaggregazione per estrarre le cellule T necessari per citometria a flusso hanno limitato l’efficacia in tessuti non linfoidi3.
Noi ed altri abbiamo sviluppato metodi utilizzando peptide-caricato MHC di classe I e classe II tetramer o multimer reagenti per macchiare le cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche in tessuti4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST questi metodi consentono la determinazione della posizione, abbondanza e fenotipo di cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti e forniscono un mezzo per rilevare di queste celle relative altre cellule e strutture nei tessuti. Il nostro gruppo ha utilizzato estesamente MHC-ho tetramero macchiatura per studiare il virus di immunodeficenza umana (HIV) – e virus dell’immunodeficienza delle scimmie (SIV) – cellule di T di CD8 specifiche nei tessuti linfoidi, genitale e rettale per acquisire una comprensione di HIV e SIV immunopatogenesi e per identificare correlazioni di vaccinazione successo strategie14,15,16,17. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una tecnica che combina IST con ibridazione in situ (ISH) di localizzare e quantificare le cellule T CD8 specifici virus e cellule infettate da virus nei tessuti e di determinare i livelli di effettore–obiettivo in vivo 18 , 19.
Qui, descriviamo un protocollo utilizzando peptide-caricato MHC-I tetrameri per macchiare le cellule CD8 T antigene-specifiche nelle sezioni di tessuto fresco, a tessuti controcolorazione con IHC e quantificare le cellule con fenotipi specifici nei compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse sono state usate nella nostra recente pubblicazione da Li et al., in cui abbiamo determinato la posizione, l’abbondanza e fenotipo delle cellule di T di SIV-specific in tessuto linfoide durante l’infezione cronica di SIV in macachi20.
Per questa procedura, tessuti freschi sono sezionate e incubate durante la notte con caricamento del peptide di MHC-I tetrameri coniugati a molecole di tiocianato di fluorescina (FITC). Quindi sono fissati in paraformaldeide. Dopo aver sistemato il tessuto, il segnale dai tetrameri MHC viene amplificato usando gli anticorpi di coniglio anti-FITC e incubate con anticorpi di IgG di anti-coniglio fluorescente contrassegnati, che amplificano ulteriormente il segnale dai tetrameri associati. IHC è utilizzato in combinazione con IST per caratterizzare le cellule T antigene-specifiche e le cellule circostanti. Gli anticorpi che riconoscono epitopi sulla superficie delle cellule o nello spazio extracellulare sono inclusi in incubazione primaria con i tetrameri. Gli anticorpi che riconoscono epitopi intracellulari richiedono permeazione della parete della cellula prima della colorazione. Le sezioni di tessuto macchiato sono Imaging utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando software confocale. Cellule con etichettate vengono quantificate utilizzando software di microscopia confocale o ImageJ. Il protocollo descritto può essere utilizzato a macchiare essenzialmente qualsiasi cellule CD8 T antigene-specifiche in qualsiasi tessuto per cui MHC-I tetrameri sono disponibili.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST combinato con IHC fornisce uno strumento essenziale per rilevare, caratterizzare e quantificare le cellule CD8 T antigene-specifiche in ambienti nativi con il contesto di altre cellule e strutture del tessuto. Qui, abbiamo descritto le procedure dettagliate per IST combinato con IHC, seguita da analisi dell’immagine quantitativa, per determinare la posizione, l’abbondanza e fenotipo di cellule T CD8 antigene-specifiche nei linfonodi da macachi rhesus. Macchiatura simile può essere applicata all’essere umano, del mou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede dal National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
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