Summary
Burada, situ MHC-tetramer boyama immünhistokimya yerelleştirme, fenotip ve dokularda antijen spesifik T hücrelerinin miktarını belirlemek ile bir araya getiren bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı diğer hücre tipi ve dokularda yapıları göreli antijen spesifik CD8 T hücrelerinin kayma ve fenotipik özellikleri belirlemek için kullanılır.
Abstract
T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Akış Sitometresi tarafından analiz antijen spesifik T hücrelerinin MHC-tetramer boyama geliştirme çalışma ve T hücrelerinin immunobiology anlamak yeteneğimizi devrim yarattı. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi antijen spesifik T hücreler diğer hücrelere ve dokulara ve geçerli yükünün teknikleri yapıları kayma lokalizasyonu belirleyemiyor T ayıklamak için hücreleri için Akış Sitometresi etkinliği olmayan lenfoid dokulara sınırlı. Situ MHC-tetramer (IST) Boyama belirli antijenleri dokularda ilgi için T hücreleri görselleştirmek için bir tekniktir. İmmünhistokimya (IHC) ile birlikte, bereket, konumu ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında IST belirleyebilirsiniz. Burada, leke ve antijen spesifik CD8 T hücreleri, belirli doku bölmeleri içinde yer alan belirli fenotipleri ile numaralandırmak için bir protokol açıklayın. Bu işlemleri başlıklı Li vdtarafından bizim son yayında kullanılan aynıdır "köklerinin kısmen CD8 tarafından bastırılmış hücrelerde Simian immün yetmezlik virüsü üreten hücreleri+ In Vivo." Çünkü onlar, fenotip, yerelleştirmek için kullanılan ve aslında herhangi bir antijen spesifik CD8 T hücre MHC tetramers herhangi bir doku elde edilebilir ölçmek açıklanan yöntemleri genel olarak geçerlidir.
Introduction
T hücreleri gibi algılama ve virüs bulaşan hücreleri ortadan kaldırarak, otoimmüniteye önlenmesi, antikor ve algılama ve kanser hücrelerinin eleme B-hücreli ve plazma hücreli üretimde yardımcı birçok immünolojik işlemlere için önemlidir. Geliştirme peptit/MHC sınıf ı antijen spesifik boyama CD8 T hücreleri1 ve MHC sınıf II tetramer CD4 T hücre2 / Akış Sitometresi tarafından boyama daha yeni geliştirme çalışması ve anlamak yeteneğimizi devrim tetramer immunobiology T hücrelerinin. Son derece yararlı olsa da miktar ve fenotip antijen spesifik T hücreleri belirlemek için Akış Sitometresi diğer hücreleri ve yapıları dokularda ve geçerli antijen spesifik T hücrelerinin kayma yerelleştirme tespiti için izin vermez T hücreleri ayıklamak için yükünün teknikleri etkinliği olmayan lenfoid doku3Akış Sitometresi için sınırlı.
Biz ve diğerleri peptid yüklü MHC sınıf ı ve sınıf II tetramer veya multimer reaktifler antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücreleri doku4,5,6,7, leke yöntemleri kullanarak geliştirdik 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. bu IST yöntemleri konumunu, bereket ve fenotip antijen spesifik CD8 ve CD4 T hücre dokularında belirlenmesi için izin ve diğer hücre ve dokularda yapıları göreli bu hücrelerinin tespit etmek için bir yol sağlar. Bizim grup yoğun MHC kullanılan-ben insan immün yetmezlik virüsü (HIV) - ve maymun immün yetmezlik virüsü (SIV) - çalışmaya boyama tetramer lenfoid, genital ve rektal dokularda HIV ve SIV immunopathogenesis anlamak için belirli CD8 T hücreleri ve başarılı stratejileri14,15,16,17ilişkilendirir tanımlamak için. Buna ek olarak, aynı zamanda IST in situ hibridizasyon (ISH yerelleştirilmesine ve virüs özgü CD8 T hücreleri ve hücre bulaştırmak virüs ölçmek için) ile birleştirir bir teknik dokularda ve in vivo efektör hedef düzeylerini belirlemek için geliştirdiğimiz 18 , 19.
Burada, MHC peptid yüklü bir iletişim kuralı'nı tarif-ben tetramers antijen spesifik CD8 T hücreleri, taze doku bölümlerde için counterstain doku IHC kullanarak leke ve belirli doku bölmeleri içinde belirli fenotipleri hücrelerle ölçmek için. Bu bizim son yayında Li hangi biz konumunu, bereket ve fenotip lenfoid doku SIV özgü T hücrelerinin makak20kronik SIV enfeksiyon sırasında tespit ve ark.tarafından kullanılan aynı yordamlardır.
Bu yordam için taze doku kesitli ve gecede peptid yüklü MHC ile inkübe-ben tetramers Birleşik floresein thiocyanate molekülleri (FITC). O zaman paraformaldehyde içinde sabitlenir. Doku düzelttikten sonra MHC tetramers sinyalini tavşan anti-FITC antikorları kullanarak ve daha fazla ilişkili tetramers sinyali yükseltmek fluorescently tagged Anti-tavşan IgG antikorlar ile inkübe güçlendirilmiş. IHC IST ile birlikte antijen spesifik T hücreleri ve çevreleyen hücreleri tanımlamak için kullanılır. Hücre veya hücre dışı alanda yüzeyinde epitopları tanımak antikorlar tetramers ile birincil kuluçka eklenir. Hücre içi epitopları tanımak antikor boyama önce hücre duvarı Permeasyon gerektirir. Lekeli doku bölümleri confocal bir mikroskop kullanarak yansıma ve confocal yazılım kullanılarak analiz. Etiketli hücreleri ImageJ veya confocal mikroskobu yazılım sayılabilir. Açıklanan protokol için hangi MHC antijen spesifik CD8 T hücre herhangi bir doku aslında herhangi bir leke için kullanılabilir-ben tetramers mevcuttur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gün 1: taze doku kesit ve birincil kuluçka
- kullanımı bir neşter taze doku küçük (yaklaşık 0.5 cm geniş x 0.5 cm boyunda) parçalar halinde kesilmiş. Ayrı ayrı her dokusu bir dalgıç ile tutkal ve PBS içinde 3-5 mL ile % 4 düşük-melt özel katıştırabilirsiniz. Pistonu bir etiket kullanarak doku bilgileri ile etiketleyin. Nedense odamızda buz kovası içinde soğutulmuş bir sahibi katılaşmaya koymak.
- Microtome ve 200 µm. yükleme jilet microtome ve INSERT pistonu bölümlerine kalınlığı monte microtome banyoda dokusuyla kümesi açın.
- Fosfat tamponlu tuz heparin (PBS-H) ile 100 µg/mL veya 18.7 U/mL heparin PBS RNA korumak için ve potansiyel ISH uygulamalar aşağı izin vermek için ekleyerek hazırlayın. Katıştırılmış dokuyla soğutulmuş, steril PBS-h 100-120 mL kapsayan microtome banyo doldurmak 0 - sıcaklıkta korumak için Bath'a PBS-H buz küpleri ekleyin 2 ° C. Başlat microtome ve kesim 200 µm bölümleri dokusuna.
Not: Dokularda hücresel hareketlilik en aza indirmek buzda soğutulmuş doku tutmak önemlidir ve o soğutulmuş taze doku bölümüne daha kolay olduğu için. PBS yalnız-ebilmek var olmak kullanılmış Eğer aşağı akım ISH için bir planımız. - İyi bir microtome ile (Örneğin, bağırsak ve akciğer), kesmeyin dokuları kullanmak için bir bistüri veya jilet doku ince şeritler halinde kesmek için alternatif olarak, 200 µm mümkün olduğunca yakın.
- Deneysel örnek bilgiler ile 24-iyi doku kültürü plakalar kapak etiketi ve karşılık gelen wells için yapılan doku chambers yerleştirin. Bölümleri bir doku odasına aktarmak için bir fırça set 1 mL içeren bir 24-iyi doku kültürü kalıbının kuyuya kullanım soğutulmuş PBS-H.
Not: Yeniden kullanılabilir doku chambers boyama başlatmadan önce yapılmalıdır. Doku Odalar bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp kullanılarak yapılabilir ve Kafes Tel. Bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt ek-Kapiler tüp alt kesmeye keskin jilet kullanın. Tel örgü tüpün dibinde delik uyacak bir daire kes. Isı kadar kızgın Bunsen burner kullanarak tel kafes daire. Tel kafes daire çok hızlı bir şekilde aşağı ayarlamak ve tüp mesh itin. Tel örgü güvenli bir şekilde tüp altına yapıştırılmış ve tüp keskin jilet kullanarak 3 mL işareti üst kapalı dikkatle kesin emin olun. İlâ 3 doku bölümleri her doku odasına veya en çok 1 cm 2 doku iyi başına koy. Wells Çapraz bulaşma kaçınmak için farklı antikor kombinasyonları ile arasında en az bir boş şey devam. - Devam et için birincil tetramer ve hemen tüm kesme bölümleri transfer doku odaları içine bitirdikten sonra boyama antikor. Sular altında ve her zaman PBS-H 1 mL soğutulmuş bölümlerine devam.
- Kuluçkaya doku bölümlerle gecede 0,5 µg/mL FITC Birleşik, peptid yüklü MHC-ben tetramers PBS-H %2 normal keçi serum (NGS) ile seyreltilmiş. Fare veya hücre dışı epitopları bu kuluçka ilgi yönelik diğer tavşan olmayan antikorlar içerir (Örneğin, fare anti-CD8 antikorlar PBS-h %1:500 2 ile seyreltilmiş NGS). Her kuyuya 1 mL sulandırılmış antikorları yerleştirin.
Not: CD8 antikorlar, bazı artırabilir ve bazı T hücre reseptörü 4 , 21 ' e bağlama MHC tetramers engellediğini seçerken özen gösterilmelidir. Burada açıklanan fare Anti-insan CD8 antikor kararsız ve bazen biraz zayıf boyama sonuçlanmaktadır. O burada çünkü bu tek sigara-tavşan ve fare CD8 antikor test o lekeli rhesus makak CD8 T hücreleri Üç Kişilik etiketleme için kullanılır. - 1 mL çözeltisi iyi birincil antikor ve sonraki tüm incubations için kullanın ve bu ve tüm izleyen incubations sallanan bir platformda plakalı 4 ° C'de gerçekleştirmek.
Not: Doku serbestçe odasında float.
2. 2. gün: Fiksasyon ve ikincil kuluçka
- birincil kuluçka sonra soğutulmuş PBS-H 20 min için 1 mL ile iki kez bölümlerini her yıkama yıkamak. Bunu karşılık gelen Wells soğutulmuş PBS-h 1 mL içeren bir farklı 24-iyi doku kültürü plakasına doku chambers aktararak.
Not: içindekiler--dan bir deneysel örneği diğerinin içine doku odaları arasında taşırken damla değil dikkatli olun. Benzer şekilde tüm sonraki incubations ve yıkama için doku odası uygun bir çözüm içeren temiz bir tabağa aktarın. Doku chambers bölümlerde bölümleri doku chambers taraf için sıkışmış değil emin olmak için yordamı sırasında izlemek emin olun. Eğer çözüm içine onlar geri onları itmek. - 1 mL taze PBS tamponlanmış %4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 2 h ile bölümleri düzeltmek (aşırı düzeltmek değil). Soğuk PBS-H iki kez 5 dakika süreyle ile yıkama
Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.
Not: Eğer hücre içi epitopları algılamak için antijen alma ve permeabilization tabi, antijenleri paraformaldehyde fiksasyon sonra 0.01 mol üre bölümlerde kaynatılarak alınabilir. - Bölümleri 0,01 mol üre içeren 24-şey kültür kalıplara aktarmak ve bu plakaları bir mikrodalga fırında yerleştirin. Üç kez için yaklaşık 10 bölümleri kaynatın s 30 olmak üzere toplam her s.
Not: çok dikkat et, kaynar olarak çözüm bölümleri dışında kuyuları zorlayabilirsiniz. Bu durumda, bölümleri doku odasının tarafında veya kapak plaka uygun doku odası altına geri itmek için bir fırça kullanın. - Önceden ikincil antikor kuluçka için permeabilize ve doku bölümleri PBS-H, % 0.3 deterjan (PBS-H-T) ve % 2 içeren engelleme çözümde kuluçka tarafından blok NGS bir rocker 4 ° C. gerçekleştir sonraki antikor incubations ile 1 h için üzerinde PBS-H-T/2% NGS.
- İkincil kuluçka için tavşan anti-FITC seyreltilmiş antikor 1:10,000 PBS-H-T/2% NGS içeren wells doku chambers bölümlerde aktarmak. Gecede kuluçkaya.
- Yerine counterstaining kullanarak fare anti CD20 antikor 1: 200 PBS-H-T/2% NGS içinde seyreltilmiş. Bu seçenek için gerekirse epitopları almak, hücreleri nüfuz ve yukarıda açıklandığı gibi bu kuluçka önce engellemek.
3. 3. gün: Üçüncül kuluçka
- sonra ikinci kuluçka, balıklarda üç kez PBS-H en az 20 dakika süreyle 4 ° C'de yıkama
- İle ilgili son bir kuluçka fluorescently antikorlar (Örneğin, keçiyi Anti-tavşan yeşilimsi sarı, keçi Anti-sıçan konjuge kadar kırmızı boya ve keçi Anti-fare konjuge yeşil boya antikorlar seyreltilmiş 1:5, 000, Birleşik etiketli gerçekleştirmek 1:5, 000, 000 ve 1:2, sırasıyla, PBS-H-T/2% NGS içinde). Gecede kuluçkaya.
Not: Bu noktada, kuluçka üç gün boyunca gerekirse genişletilebilir. Tabakları kalay folyo içinde bu incu sırasında sarma tarafından ışıktan korunan bölümleri tutmakbation adım ve bundan sonra ışık fluorophores quenches gibi.
4. 4. gün: bölümleri montaj
- yıkama bölümler üç kez PBS-H içinde en az 20 dk.
Not: Eğer aşağı akım ISH 19 için planlama, 1 h için %4 paraformaldehyde bölümlerde tetramers ve antikorlar yerde güvenli ve sonra yıkayın PBS-H 5 min için iki kez bölümlerle düzeltmek için.
Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. - Bölümleri mikroskop slayda aktarmak için bir fırça kullanın. Çok fazla doku poke değil dikkatli olun. Her bölümün gliserol/jelatin içeren 4 mg/mL n-propil gallat veya bir fluorophore koruyucu içeren başka bir montaj orta kat. Kapak ile coverslip.
- -20, bir ışık korumalı slayt kapsayıcısında slaytları depolamak ° C. doku kültürü plakaları durulama ve kapakları alkol kullanarak etiketlerinizi kaldırın.
Not: Tabakları kullanılabilmesinden.
5. Confocal mikroskop görüntüleri edinimi
- confocal mikroskop her fluorophore ( şekil 1A ve B) için uygun lazerler ve filtreleri kullanarak, yakalama yüksek çözünürlüklü görüntülerle.
Not: Bu örnekte, confocal mikroskop (Tablo reçetesi görmek) kullanıldı. Görüntüleri yeşilimsi sarı etiketli antijen spesifik T hücreleri, % 10 güç 488-nm lazer yeşil etiketli CD20 ifade etme B hücreleri için ve % 15 güç 640-nm lazer kadar kırmızı etiketli CD8 T hücreler için % 20 güç 561 nm lazer kullanılarak toplanmıştır. 20 X objektif ve sayısal bir diyafram 0,8 kullanıldı. - Sırayla birden fazla 800 x 800 piksel alanlarda üç kanal z-serisi 3 µm (veya diğer) aralıklarla toplamak. Bir montaj toplanan alanlarının oluşturmak ( şekil 1 c -E). Karşılık gelen slayt bilgilerini temel alarak her montaj görüntü adı ve çözümlemeyi kaydetmek.
- İlgili confocal mikroskop analizi ve miktar yazılım veya ImageJ kullanarak sayısal görüntü analizi gerçekleştirmek.
6. Sayısal görüntü analizi
Not: sayısal görüntü analizi confocal mikroskop analizi ve miktar yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir veya ImageJ yazılım kullanarak. Burada, ImageJ örnek olarak kullanılmıştır.
- Açık bir confocal montaj ( şekil 2A) ImageJ penceresine sürükleyerek.
Not: ImageJ birçok farklı confocal mikroskoplar tarafından toplanan montages doğrudan açabilirsiniz. Montaj ImageJ tarafından doğrudan açılamaz Eğer z-tarama onu açmak için TIFF dosyaları olarak dışa aktarmak - Seçilen z tarama analizi için yinelenen (" görüntü "-> " yinelenen ") ( şekil 2B).
- Farklı Kanallar split (" görüntü "-> " renk "-> " Split kanalları ") ( şekil 2C).
- Objektif ve basarak ROI yöneticisi eklemek için karşılık gelen kanal YG nicel analiz çizmek " T " üstünde belgili tanımlık klavye. Tedbir alan.
Not: ImageJ yatırım Getirisi Müdürü alan gösterir µm 2 ' ( şekil 2B). - Floresan parlaklık ve kontrast çözümlenmesi için kanal (" görüntü "-> " ayarla "-> " Parlaklık/Kontrast ") ( şekil 2E).
- Yatırım Getirisi Görüntüye Düzleştir (" ROI Yöneticisi "-> " Flatten ") ( şekil 2F).
- Görüntü kullanarak pozitif hücrelerinin ölçmek " çok noktalı " aracı ( Şekil 2 g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 confocal görüntüleri confocal mikroskop kullanarak toplamak nasıl gösterir. Şekil 2 sayısal görüntü analizi ImageJ kullanarak gösterir. Şekil 3 ve 4 temsilcisi bir SIV dokulardan lenf nodu görüntülerini MHC tetramers, CD8 antikorlar ve CD20 antikorları ile lekeli rhesus makak enfekte göstermek ve MHC-tetramer boyama özgüllüğü göstermek için hizmet. Şekil 3 karşılaştırır MHC sınıf ı tetramers bir peptid lekeli MHC sınıf ile aynı dokudan bölümlerine göre SIV üzerinden yüklü tetramers yüklü ile alakasız bir peptid. Şekil 4 MHC/SIV-peptid tetramer ile lekeli hücreleri CD8 antikorlar ama değil B hücreleri leke CD20 antikorları ile birlikte lekeli olduğunu göstermektedir. Şekil 5 lenf nodu üzerinde farklı anatomik bölmeleri içinde belirli fenotipleri hücrelerle lekeli tetramer miktar için kullanılan birden çok confocal z-serisi alandan oluşturulan bir montaj bir örneği gösterilir. Genişleme CD20 boyama ve bazıları ortak bir işaretleyici T hücre aktivasyonu ve nükleer silahların yayılmasına karşı olan Ki67 hızlı hangi hücreleri MHC tetramer lekeli tespit edilebilir, çevredeki T hücre bölge tarafından belirlenen bir B hücre folikül ile lenf nodu bir alanı gösterir. Boyama bu kombinasyon SIV özgü CD8 T hücre içinde ve dışında ilişki SIV özgü CD8 T hücreleri ve diğer Ki67 ifade hücrelere, B hücre köklerinin ve B hücreleri fenotip tayini sağlar.
Şekil 1: Temsilcisi Confocal görüntüleri Confocal mikroskop kullanarak toplamak nasıl gösteren ekran. (A)edinme confocal görüntüleri toplamak için kullanılan modu. (B) kanalları resim koleksiyonu için kullanılan. (C) 20 X amaç ve 800 x 800 piksel alanları resim koleksiyonunda kullanıldı. (D) A sıralı z-yığın 3 µm aralıklarla toplanmıştır. (E) fayans betimlemek ve Albümdeki birden çok alanı toplamak için kabul edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Temsilcisi nicel gösteren ekran görüntü analizi ImageJ. (A)açık ImageJ penceresine sürükleyerek confocal montaj. (B) yinelenen z-tarama analizi için. (C) farklı Kanallar bölün. (D) çizmek nicel analiz karşılık gelen kanal ROI objektif ve "T" tuşuna basarak ROI yöneticisi eklemek için (E) ayarlama Floresans parlaklık ve kontrast kanal analiz edilecek. (F) Flatten yatırım Getirisi görüntüde. Pozitif görüntü hücreleri (G) sayısı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : IHC SIV-enfekte Rhesus makak aksiler lenf nodu bölümleri ile birlikte, IST. SIV Nef YY9 peptidler ile yüklenen Amca - A * 02 tetramers antijen spesifik CD8 T hücreleri leke için kullanılan ve benzer tetramers alakasız bir FLP peptid Hepatit B virüsü ile yüklenen bir negatif kontrol (kırmızı) kullanılmıştır. Fare anti CD20 antikorları CD20 leke için kullanılan+ B hücreleri (yeşil) ve CD8 leke için kullanılan fare anti-CD8 antikorlar+ T hücreleri (mavi). (A) A temsilcisi görüntü bir aksiler lenf nodu bölümünden lekeli YY9 tetramers, CD20 ve CD8 ile antikor. (B) aynı görüntü paneli olduğu gibi bir YY9 tetramer gösterilen leke yalnız. (C) temsilcisi görüntü aynı aksiler lenf düğümden bir bölümünün lekeli FLP tetramers ve CD20 ve CD8 antikorları ile. (D) aynı görüntü paneli olduğu gibi C FLP tetramer ile yalnız leke. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : IST MHC-tetramer boyama özgüllüğü gösterilen IHC ile kombine. Amca - A * 02 tetramers Nef YY9 peptidler etiket SIV özgü CD8 T hücreleri (kırmızı), fare anti CD20 antikorları için etiket B hücreleri (yeşil) ve fare anti-CD8 karşı antikorlar için etiket CD8 T hücreleri (mavi) (A yüklü ile lekeli temsilcisi aksiler lenf nodu bölüm ). Bir SIV özgü CD8 T hücre tetramer + (B), CD20 olduğunu- (C) ve CD8+ (D). Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: IST fenotip antijen spesifik CD8 T hücreleri, bereket ve konumunu göstermek için IHC ile kombine. (A)temsilcisi aksiler lenf nodu bölüm Amca - A * 02 tetramers Nef YY9 peptidler SIV özgü CD8 T hücreleri (kırmızı), Ki67 antikorlar Proliferasyona hücreleri (yeşil) etiket ve etiket B hücreleri (mavi) IgM antikor etiketlemek için yüklü ile lekeli. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) genişleme paneli A. IgM boyama içinde seçili bir bölge tanımlar "F;" olarak işaretlenmiş foliküler alanı extrafollicular alanı "EF" işaretlenmiş Tetramer+ hücreleri oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. temsilcisi tetramer+ Ki67 =- hücre (C, D, E) ve tetramer+ Ki67+ hücre (F, G, H). Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IHC ile kombine IST tespit, karakterize ve antijen spesifik CD8 T hücreleri diğer hücre ve doku yapıları bağlamı ile doğal ortamlarda miktarının için gerekli bir araç sağlar. Burada, biz fenotip antijen spesifik CD8 T hücrelerinin rhesus makak lenf düğümleri, bereket ve konumunu belirlemek için nicel görüntü analizi tarafından takip IHC ile birlikte IST için ayrıntılı yordamlar nitelendirdi. Benzer boyama uygulanan insan, fare veya diğer türler doku hangi MHC için olabilir-ben tetramers mevcuttur. Buna ek olarak, peptid MHC sınıf II tetramer veya dextramer boyama antijen spesifik CD4 T hücreleri doku4,5,6,7, 'etiketlemek için nispeten benzer yöntemlerini kullanarak gerçekleştirilebilir 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST da belirlemek için ISH ile kombine edilebilir, örneğin,18,19 vivo efektör hedef hücre düzeyleri. Gelecekte, IST/IHC gelişmiş in situ RNA ve DNA algılama yöntemleri ile birleştirerek IST/IHC daha fazla taşımak ilginç olacak. Situ hibridizasyon deneyleri son gelişmeler RNAscope ve DNAscope24geliştirme içerir. Bu teknikleri hedef RNA ve DNA tespiti dokularda için izin verir. Bu metodolojileri IST IHC ile aynı anda virüs-özel-CD8 T hücreleri, viral RNA, viral DNA ve antikor etiketli antijenleri ilgi algılamak için birleştirmek heyecan verici olacak.
Biz aslında IST yöntemleri taze dokular, bir kısa süreli ve donmuş doku4,'son yıllarda tespit edildi dokular ile açıklanan iken onlar sürekli olarak yüksek kaliteli lekeleri üretmek gibi biz sadece taze doku kesitler, kullandık ve kalın doku bölümleri hücrelerde incelenmesi için izin verir. Gibi işlemleri bir alternatif burada sunulan, bir tetramers dokulara geçerlidir, gecede kuluçkaya, düzeltmek, embed ve orta buz gibi cryopreserve (örneğin, OCT), dondurulmuş ince kesitler üretmek ve IHC gerçekleştirmek daha sonra22. Benzer şekilde, rutin bir alt tetramers ile doku bölümlerin yalnız leke ve sonra bölümleri Ekim içinde belgili tanımlık gelecek için ek counterstaining birleşimlerine izin vermek için dondurma. Buna ek olarak, Qdot 655 Birleşik peptid-MHC multimers doğrudan antijen spesifik T hücreleri cryopreserved doku bölüm13' te görselleştirmek için kullanılabilir.
Biz burada dolaylı tetramer tarif var boyama. Doğrudan boyama APC veya PE Birleşik tetramers kullanarak da4,22çalışmak gösterilmiştir. Bu durumda, gerekli MHC tetramer konsantrasyonu dolaylı tetramer boyama kullanılan daha yüksektir. Bizim ellerde 20 µg/mL tetramer APC etiketli bir konsantrasyon antijen spesifik hücreleri tespit de etkili oldu. Ancak, boyama yoğunluğu güçlendirme ile anti-FITC antikorlar içeren çok dolaylı etiketleme ile elde daha düşük.
Taze doku kesme hafifletti taze doku bölüm olarak kesme işlemi için bir sıkıştırma tabanlı microtome kullanımı ( Malzeme tablogörmek) titreşimli microtome23kullanarak göre olduğunu bulduk. Ancak, sıkıştırma tabanlı microtome kullanılabilir olmadığı durumlarda, bir titreşimli microtome veya neşter taze doku kesit için kullanılabilir.
Bu tekniğin önemli bir sınırlama taze doku kullanmaktır. Onlar hemen dikkat ve işlem gerektirdiği için taze doku kullanarak sabit ya da buz dokular çok daha zordur. Başarılı bir şekilde taze doku doku kültürü orta veya PBS-H. gece buzda sevk ettiğiniz Ancak, kargo ile zaman zaman sorunlar olmuştur; Örneğin, kar fırtınaları sevk irsaliyesi 48 saat veya daha fazla dokuların ertelediniz. Bu durumda, taze doku kesitli ve bu genellikle 48 saat sonrası ayıklama lekeli belirli boyama, bazı doku bozulması işaretleri ile göstermek bulundu; 72 h sonrası ayıklama lekeli dokular çok boyama için bozulmuş. Ayrıca çok soğuk ya da çok yakın belgili tanımlık doku dokular nakliye sırasında dondurabilirsiniz olacak bu buz blokları ile taze dokuların sevk irsaliyesi bulduk; Bu dondurma genellikle boyama için doku yok eder. Böylece, bu son derece soğuk ama değil donmuş taze doku sevk etmek ve IST başlatmak için 24 h taze doku aynı zamanda içinde işleme boyama öğrenci büyük bir gerektirir ve personel zaman, birden fazla hayvan dokulardan olarak veya çalışmaya katılanların olamaz önemlidir toplanan ve daha sonraki bir tarihte birlikte lekeli. Bu zorluklara rağmen taze doku bölümler güzel, belirli IST/IHC boyama için en iyi seçenek olduğunu öğrenin.
Burada açıklanan IST/IHC yönteminin başka sınırlama dolaylı boyama yaklaşımdır. Hayvan ikincil antikor kombinasyonları oluşturmaya uygun farklı türleri sayısı sınırlamaları nedeniyle dolaylı antikor yöntemleri için sadece üç veya dört floresan antikor kombinasyonları teker teker boyama boyama tarafından sınırlıdır. Bu bir doku levha üzerinde toplanan bilgi miktarını sınırlandırır. Doğrudan IHC boyama ve bu sınırlama üstesinden sekiz veya daha fazla antikor öğesini antijenleri ile dolaylı yöntemlerine göre daha zayıf bir floresan sinyal üreten her antikor de olsa aynı anda, algılama yetenekleri, genişletebilirsiniz. Bu nedenle, dolaylı IHC dolaylı IHC alternatif olarak dokular, IST-lekeli counterstaining için artmış antijen spesifik CD8 T hücreleri IST algılama ile birleştirildiğinde hücresel antijenlere sayıda tespiti için izin kullanılabilir.
Bazı durumlarda, önemli autofluorescence ve/veya non-spesifik tetramer veya antikor bağlama IST/Ish ile oluşabilir. Bu nedenle, iyi pozitif ve negatif denetimlerin arka plan belirli lekeleri ve autofluorescent boyama ayırt etmek gereklidir. İyi negatif kontrol MHC için ben tetramers negatif kontrol doku içerir (Örneğin, sigara enfekte dokularda; MHC ile lekeli dokulara tetramers alakasız peptidler veya alakasız MHC tetramers; ile veya bir tutam, hayır ile lekeli dokular yüklü tetramers ama antikorlar yükseltecek ile).
Özetle, MHC ı IST IHC ile kombine fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için değerli bir araçtır. Antijen spesifik CD8 T hücreleri ile diğer hücre tipleri ve tutulan doku yapıları göreli yerelleştirme doğal ortamlarda tespiti için bu yöntemi sağlar. Çünkü, fenotip, yerelleştirilmesine ve aslında herhangi bir antijen spesifik CD8 T hücre için hangi MHC tetramers herhangi bir doku, kullanılabilir ölçmek için kullanılabilir Bu yöntem genel olarak geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser tarafından desteklenmiştir halk sağlığı hizmeti verir Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
