שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי
Summary
כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.
Abstract
השחלה הוא האיבר הראשי של מערכת הרבייה הנשית, חיוני לייצור של גמטות הנשי ולבקרה המערכת האנדוקרינית, אבל את מערכות היחסים המורכבות מבני תלת מימד (3D) להערכת ארכיטקטורות של השחלה מתוארים לא טוב. על מנת להמחיש את חיבורי 3D ואדריכלות של כלי הדם בשחלה ללא פגע, הצעד החשוב הראשון היא להפוך את השחלה שטיחות ברורה. כדי למנוע התכווצות של רקמות, היינו את הידרוג המבוסס על קיבוע בהירות פסיבי (החלפת השומנים נקה קשיח hybridized אקרילאמיד הידרוג רקמות הדמיה / Immunostaining/ב באתרו הכלאה-תואם) פרוטוקול השיטה כדי לנקות שחלה ללא פגע . Immunostaining קונפוקלית multiphoton מתקדמות, תמונות 3D-שחזורים ואז שימשו את הפריט החזותי של כלים השחלות נימים הזקיקים. באמצעות גישה זו, אנחנו הראו מתאם חיובי משמעותי (P < 0.01) בין האורך נימים הזקיקים, נפח של הקיר הזקיקים.
Introduction
הזקיק הוא יחידת מבניים ופונקציונליים של השחלה, התפתחותו קשורה מאוד להערכת בתוך השחלה. כלי הדם לספק תזונה והורמונים לנשירה, וכך לשחק תפקידים חשובים גדילה, התבגרות של זקיקי1.
שילוב של טכנולוגיות, כולל כלי דם סלקטיבי סמני עכבר הטרנסגניים מודלים, פיתוח פרמצבטי, הגדילו את הידע שלנו אודות רשתות כלי דם השחלות, אנגיוגנזה את תפקוד כלי הדם folliculogenesis. השחלה מכונה איבר פעיל כי זה remodels שונים רקמות, רשתות כלי דם במהלך folliculogenesis, ביוץ. כזה שיפוץ פעיל ב גודל ומבנה של כלי נדרש עבור הפונקציה הביולוגי של פיתוח, גיוס זקיקים.
שיטות היסטולוגית ו histomorphometric מסורתיות באמצעות סעיפים השחלות ו immunolabeling של כלי הדם מוגבלות דו-ממדית (תמונות דו-ממד)2. עם התפתחות טכנולוגיות שחזור תלת מימדי (3D), תמונות דו-ממד של רקמות פרוסות יכול להיות חופף כדי להפוך מבנה תלת-ממדי, אך לשיטה זו יש עדיין כמה מגבלות — חלוקתה של הרקמה יכול להרוס את מזערים, חלקים מסוימים לעתים קרובות חסרים רקמות, עבודה משמעותית מעורב בביצוע שחזורים תלת-ממדיים מתמונות המתקבל פרוסות. כל רקמה הדמיה תלת-ממדית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול להתגבר על רבות מההגבלות הללו, אך שיטות אלה מוגבלות להערכת אנגיוגנזה של השחלה עובריים3. השימוש ברקמה כל ניקוי שיטות כגון בהירות4 יכול להגביר את עוצמת מטמיעים כדי לפתור את הבעיות האלה של השחלות כמחנכת, למבוגרים, שיטות כאלה לספק אישור אופטי של השחלה ללא כל העיוותים מבנית. הדמיה של הארכיטקטורה תלת-ממד של השחלה שלם מספק מסד נתונים של תמונה מדויקת עבור תוכנת ניתוח התמונה, כגון חבילת התוכנה Imaris נעשה שימוש בעבודה זו.
שיפוץ של השחלה ברחבי לבגרות הוא חלק מערכת פיזיולוגית דינאמית, וזה יהפוך השחלה מודל מצוין עבור חקירות ברגולציה של אנגיוגנזה. יתר על כן, להעריך את התפקיד של כלי הדם השחלות בתנאים פיפטות של מערכת הרבייה הנשית כגון תסמונת שחלות פוליציסטיות או סרטן השחלות יכול להילמד דרך רקמות השחלה כל הדמיה. הפיתוח של שיטת בהירות פסיבית ושימוש של תמונה מתקדם ניתוח תוכנה סיפקו מידע מרחבי מפורט על הקשרים בין כלי הדם ולא השחלה מבנים כמו זקיקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי, אנו מציגים 3D הדמיה כדי להעריך את קשרי הגומלין בין נימים זקיקים גידול בודדים. בעבודה הקודמת שלנו באמצעות פרוטוקול זהה 9, למדנו את התפקידים של להערכת גדולים, האינטראקציות בין זקיקים, ואת המיקום של זקיקים של השחלות העכבר ללא פגע. הגישה בהירות פסיבי אפשר לנו ללמוד מיק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן מיוחד סינית עבור והפוסט-דוקטורנטים (2014T70392 מס כדי YF), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81673766 מס כדי YF), הקרן החדשה הטרמה המורה, היסוד Zuoxue של אוניברסיטת פודאן (fudan), לבין ההתפתחות פרויקט לרפואה אינטגרטיבית-דיסציפלינות שיא שנגחאי (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
