受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine,Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine,Stanford University
Summary
ここでそのままマウス卵巣における受動的な明快さと卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化における 3 D 画像再構成法の適応を提案する.
Abstract
卵巣は、女性の生殖器系の主要な器官と雌性の配偶子の生産構造の複雑な関係との三次元 (3 D) 血管アーキテクチャが、内分泌系を制御するために不可欠です、卵巣は記述されていません。3 D の接続とそのまま卵巣の血管の構造を視覚化するために最初の重要なステップは、光学的に透明の卵巣をすることです。ヒドロゲルを用いて組織の収縮を避けるためには、受動的な明快さの固定ベース (アクリルアミド ハイブリダイズ リジッドのオフ脂質交換イメージング/染色/の場-交配-互換性のある組織ハイドロゲル) プロトコルをそのまま卵巣をクリアする方法.染色、高度な多光子の共焦点顕微鏡と 3 D 画像再構成それから卵巣の血管と濾胞性毛細血管の可視化のために使用されました。このアプローチを使用すると、有意な正の相関を示した (P < 0.01) 卵胞の毛細血管と卵胞壁量の長さの間。
Introduction
卵胞が卵巣の構造と機能の基本単位とその開発は、卵巣内にある血管に関連性の高い。血管は栄養と卵胞ホルモンと成長と1卵胞の成熟に重要な役割を担っています。
選択的血管マーカー、トランスジェニック マウス モデル、医薬品開発などの技術の組み合わせは、卵巣の血管網、血管新生、血管の機能に関する知識を増加しています。卵胞形成。卵巣は、卵胞発育と排卵の間に様々 な組織や血管のネットワークを改造するためにアクティブな器官と呼ばれます。サイズと血管の構造のようなアクティブな改造開発、採用に卵胞の生物学的機能に必要です。
卵巣のセクションおよび血管の反応を使用して従来の組織学的および組織計量方法は二次元 (2 D) 画像2に限定されます。三次元 (3 D) 再構成技術の発展に伴い、組織スライスの 2 D 画像を 3 D 構造に重ねることができますが、この方法はまだいくつかの制限を持って-微細構造の一部を破壊することが組織の区分、組織は、不足していると多くの労働力がスライスから得られた画像からの 3次元再構成の製作にかかわっています。全体組織 3 D 共焦点顕微鏡イメージングは、これらの制限の多数を克服できるがこれらのメソッドは萌芽期卵巣3における血管新生の評価に限定。生後および成体卵巣におけるこれらの問題を解決するために可視化されたボリュームを増やして全体ティッシュ クリア透明度4などのメソッドを使用して、このようなメソッドは任意の構造変形せず卵巣の光のクリアランスを提供します。そのまま卵巣の 3 D 構造のイメージングは、本作で使用されている Imaris ソフトウェア パッケージなどの画像解析ソフトウェアの正確な画像データベースを提供します。
動的な生理学的システムの一部である成人期にわたって卵巣の改造、これ卵巣血管新生の調節に調査のための優秀なモデル。さらに、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣癌などの女性生殖器系の病的な状態で卵巣血管の役割の評価は全卵巣組織イメージングを通じて学ぶことができます。パッシブのクラリティ法の開発と高度な画像解析ソフトウェアの使用は、血管や毛包などの卵巣構造の関係に関する詳細な空間情報を提供しました。
Protocol
動物を対象とするすべてのプロシージャ上海医科大学、復旦大学 (承認番号 20160225-013) の動物倫理委員会のガイドラインに従った。 1. 透明なマウス卵巣の準備 溶液の調製 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション (1 M、pH 7.6) 0.1% 準備トリトン X-100 (pbst;)。10 x PBS 原液 1 リットルを作るためには、87 g の塩化ナトリウム、NaH2PO4 …
Representative Results
我々 は受動的な卵巣の卵胞期と血管のアーキテクチャを維持すると、容器と包のラベル付きのマーカーからの最高の蛍光信号の取得をオフに迅速かつ簡単な方法にパッシブのクラリティ法を適応しました。卵胞血管の 3 D アーキテクチャは、CD31、内皮細胞6マーカーの免疫染色により決定されました。CD31 染色成体マウスの卵巣では卵胞の毛細血管と…
Discussion
現在の研究では、毛細血管と個々 の発育卵胞の間の関係を評価するイメージング 3 D を提案する.筆者らは同じプロトコル9を使用して、大血管、毛包とそのままマウス卵巣内の卵胞の場所間の相互作用の役割を検討しました。パッシブわかりやすくアプローチでは、マイクロおよびマクロ生、卵胞形成、および黄体と卵胞だけでなくさまざまな発達段階で卵巣の建築を再建?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ポスドクの中国特別基金からの助成金によって支えられた (YF に号 2014T70392)、中国の国家自然科学基金 (YF に号 81673766)、新しい教師プライミング基金、復旦大学、Zuoxue 財団、開発上海ピーク分野統合医学 (20150407) のプロジェクト。
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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Citer Cet Article
Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).