JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Tredimensionell rekonstruktion av vaskulär arkitekturen av passiv tydlighet-godkänt mus äggstocken

Published: December 10, 2017
doi:
10.3791/56141
, , ,
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine,Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine,Stanford University

Summary

Här presenterar vi en anpassning av den passiva klarhet och 3D rekonstruktion metod för visualisering av äggstockscancer vaskulatur och follikulär kapillärer i intakt mus äggstockar.

Abstract

Äggstockarna är det viktigaste orgeln i det kvinnliga reproduktiva systemet och är nödvändigt för produktion av kvinnliga könsceller och för att styra det endokrina systemet, men komplexa strukturella relationer och tredimensionella (3D) vaskulatur arkitekturer av den äggstockarna är inte väl beskrivna. För att visualisera 3D anslutningar och arkitekturen av blodkärl i intakt äggstockarna, är det första viktiga steget att göra äggstocken optiskt klart. För att undvika vävnad krympning, vi använde hydrogel fixering-baserade passiva klarhet (rensa Lipid-utbyts akrylamid-hybridiserad Rigid Imaging / immunfärgning/In situ-hybridisering-kompatibel vävnad Hydrogel) protokoll metod att rensa en intakt äggstock . Immunfärgning och avancerade multiphoton konfokalmikroskopi 3D bild-rekonstruktioner användes sedan för visualisering av äggstockarna fartyg och follikulär kapillärer. Använder denna metod, vi visade en signifikant positiv korrelation (P < 0,01) mellan längden av follikulära kapillärer och volym av follikulära väggen.

Introduction

Follikeln är den grundläggande strukturella och funktionella enheten i äggstocken och dess utveckling är starkt relaterat till vaskulatur inom äggstocken. Blodkärl leverera näring och hormoner till hårsäckarna och därigenom spelar viktiga roller i tillväxt och mognad av folliklar1.

En kombination av teknik, inklusive selektiva blodkärl markörer, transgena musmodeller och läkemedelsutveckling, har ökat vår kunskap om äggstockscancer vaskulär nätverk, angiogenes och funktionen av blodkärl i folliculogenesis. Äggstockarna är känt som ett aktivt organ eftersom det remodels olika vävnader och vaskulär nätverk under folliculogenesis och ägglossning. Sådana aktiva remodeling i storlek och struktur av fartyg krävs för den biologiska funktionen av utveckla och rekrytera folliklar.

Traditionella histologiska och Histomorfometriska metoder med hjälp av äggstockscancer sektioner och immunolabeling av blodkärl är begränsade till tvådimensionella (2D) bilder2. Med utvecklingen av tredimensionella (3D) rekonstruktion teknik, 2D-bilder av vävnad skivor kan vara överlappad för att göra en 3D-strukturen, men denna metod fortfarande har vissa begränsningar — snittning av vävnad kan förstöra mikrostrukturer, vissa delar av den vävnad är ofta saknas, och betydande arbete är involverad i att göra 3D rekonstruktioner från bilder tagna från skivor. Hela-vävnad 3D imaging med konfokalmikroskopi kan övervinna många av dessa begränsningar, men dessa metoder är begränsade till utvärderingen av angiogenes i embryonala äggstock3. Använda hela vävnad clearing metoder såsom klarhet4 kan öka volymen visualiseras för att lösa dessa problem i postnatal och vuxen äggstockar, och sådana metoder ger optiska clearance av äggstocken utan någon strukturell deformationer. Avbildning av 3D arkitekturen intakt äggstockscancer ger korrekt bilddatabas för bild analys programvara, såsom programpaketet Imaris används i detta arbete.

Ombyggnad av äggstocken under hela vuxenlivet är en del av ett dynamiskt fysiologiska system, och detta gör äggstocken en utmärkt modell för utredningar av regleringen av angiogenes. Dessutom kan utvärderar rollen av äggstockscancer blodkärl i patologiska förhållanden av det kvinnliga reproduktiva systemet såsom polycystiskt ovariesyndrom eller äggstockscancer studeras genom hela äggstocksvävnad imaging. Utvecklingen av metoden passiva klarhet och användning av avancerade bildbehandlingsprogram analys har lämnat detaljerad geografisk information om relationerna mellan blodkärl och cystor strukturer såsom folliklar.

Protocol

Alla förfaranden som berör animaliska ämnen följt riktlinjerna i djur etikkommittén vid Shanghai Medical College, Fudan University (godkännandenummer 20160225-013). 1. beredning av Transparent mus ovaryen Beredning av lösningar Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (1 M, pH 7,6) med 0,1% Triton x-100 (PBST). För att göra 1 L 10 x PBS stamlösning, blanda 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O och 28,7 g Na…

Representative Results

Vi anpassat metoden passiva klarhet till en snabb och enkel metod för passiv äggstock clearing samtidigt bevarar den follikulära och vaskulär arkitekturen och få högsta fluorescerande signalen från märkt markörer av fartyg och folliklar. Den follikulära vaskulatur 3D arkitektur fastställdes genom immunfärgning för CD31, en markör för endotelceller6. CD31 färgning i äggstockarna hos vuxna möss spårades med glödtråden algoritm och visade sambande…

Discussion

I den aktuella studien presenterar vi 3D-avbildning för att utvärdera relationerna mellan kapillärer och enskilda växande folliklar. I vårt tidigare arbete med samma protokoll 9, studerat vi roller stora kärlsystemet, interaktioner mellan folliklar, och placeringen av folliklar i intakt mus äggstockar. Det passiva tydlighet tillvägagångssättet tillät oss att studera mikro – och makro-vasculatures, folliculogenesis och inbördes relationerna mellan corpora lutea och hårsäckarna samt at…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av bidrag från den kinesiska särskilda fonden för postdoktorer (nr 2014T70392 till YF), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 81673766 till YF), den nya lärare Priming fonden, Stiftelsen Zuoxue av Fudan University och utveckling Projektet i Shanghai Peak discipliner-integrativ medicin (20150407).

Materials

Acrylamide Vetec v900845 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (Dilution 1:50)  Life Technologies A11039 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) Life Technologies A11012 https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
Bisacrylamide Amresco 172 http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) Ted Pella 14032 http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent 10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) Sinopharm Chemical Reagent 10020318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClear Celexplorer FC-102 http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm Bemis PM996 http://www.parafilm.com/products
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) Abcam ab28364 http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Sodium azide Sigma S2002 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US
Sodium chloride (NaCl) Sinopharm Chemical Reagent 10019318 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) Sinopharm Chemical Reagent 20040718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfate Sinopharm Chemical Reagent 30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Sodium hydroxide (NaOH) Sinopharm Chemical Reagent 10019718 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) Abcam ab76442 http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

Tags

3D ReconstructionVascular ArchitectureCLARITY-clearedMouse OvaryFollicle DevelopmentSomatic CellsVascular SystemNervous SystemPassive CLARITYImage AnalysisImarisPerfusionHydrogelOvarian Bursa
check_url/fr/56141?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. J. Vis. Exp. (130), e56141, doi:10.3791/56141 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image