تحديد منطقة عضلة مستعرضة الضوئية عضلات الطيران غير المباشر الكبار Melanogaster المورفولوجية
Summary
ونحن التقرير طريقة لتحديد حجم منطقة العضلات، وطريقة غير مباشرة لتحديد العضلات في البالغين المورفولوجية . علينا أن نظهر عضلات تطبيق منهجية لدينا من خلال تحليل هذه الرحلة غير المباشرة في نموذج المورفولوجية لمرض “الضمور ميوتونيك”.
Abstract
العضلات الهزال، المعروف باسم ضمور العضلات وهو النمط الظاهري مشتركة في نماذج المورفولوجية للأمراض العصبية العضلية. وقد استخدمنا عضلات الطيران غير المباشر الذباب، على وجه التحديد عضلات طولية دورسو (DLM)، تجريبية تخضع لقياس النمط الظاهري ضامر الناجمة عن مختلف الأسباب الوراثية (إيفمس). في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية تضمين عضلات الصدر يطير لتقطيع شبه رقيقة، وكيفية الحصول على تباين جيد بين العضلات والأنسجة المحيطة، وكيفية معالجة صور المجهر الضوئي لاهتزازات الحصول على بيانات قابلة للقياس الكمي و تحليل. يصف لنا ثلاثة طلبات محددة من خط الأنابيب المنهجية. أولاً، نحن إظهار الكيفية التي يمكن بها تطبيق الأسلوب التحديد الكمي لضمور العضلات في نموذج يطير ضمور ميوتونيك؛ ثانيا، يمكن أن تساعد على قياس منطقة عضلة مستعرضة تحديد الجينات التي تعزز أو منع ضمور العضلات و/أو ضمور العضلات؛ ثالثا، يمكن تطبيق هذا البروتوكول تحديد ما إذا كان مركب مرشح قادراً على تعديل كبير النمط الظاهري ضامر معطى الناجم عن طفرة المسببة للمرضأو بواسطة مشغل بيئية.
Introduction
الصدر ذبابة الفاكهة يحتوي على فئتين مختلفتين من عضلات الطيران، ومتميزة وظيفيا وفسيولوجيا وتشريحيا. هذه العضلات: التحكم في عضلات الرحلات غير المباشرة (IFM)، التي تتألف من طولية دورسو (DLM) والعضلات دورسو البطني (طبيب بيطري) (الشكل 1)، والرحلة متزامن العضلات1،2. هذه العضلات معا توليد الطاقة الميكانيكية المرتفعة المطلوبة للرحلة. الحجم والتوزيع والتصرف إيفمس rostro والذيلية السماح اتجاه سهل ل تقطيع مستعرضة3 (الشكل 2A). ولهذا السبب، اخترنا هذه العضلات لدراسة ضمور العضلات في melanogaster المورفولوجية.
رقم 1. الرسم التخطيطي للصدر ذبابة الفاكهة عرض عضلات الطيران غير المباشر الترتيب (إيفمس). (يسار) يمثل وجهة نظر أفقي و (يمين) مقطع عرضي من القفص الصدري. إيفمس تتكون من عضلات دورسو-طولية (DLM) (باللون الأحمر) والعضلات دورسو-البطني (طبيب بيطري) (باللون الأخضر).
الحفاظ على بنية الأنسجة والسيطرة على اتجاه محور دورسو البطني من أقسام نسيجية ذات الأهمية الحاسمة لضمان التقييم السليم لمنطقة عضلة مستعرضة. للحفاظ على بنية العضلات قمنا باستخدام خليط تثبيت معدلة من توملينسون et al. 4 . وعلاوة على ذلك، نظراً لعضلات الأنسجة الداخلية، هي مشكلة كتثبيت لا يمكن اختراق الخلائط للأنسجة المستهدفة كتوم من الهيكل الخارجي المورفولوجية. للتحايل على هذه المشكلة، ازلنا يطير الرأس والساقين، وأجنحة وآخر الجزئين من البطن لخلق الثقوب التي يسمح للمخلوط التثبيت لإدخال. كجزء من تثبيت البروتوكول شملنا المعاملة مع أكسيد الاوزميوم (أوسو4)5، الذي يستخدم على نطاق واسع بسبب قدرته على إصلاح الدهون، بما في ذلك الثلاثية. أوسو4 يحافظ على معظم هياكل جيد للغاية، لا سيما على مستوى الخلوية، وفي نفس الوقت يوفر على النقيض من الصورة. بعد التثبيت، تم تضمينها ثوراسيس المورفولوجية في الراتنج لمستعرضه شبه رقيقة تقطيع (1.5 ميكرومتر). لتحسين التباين والأنسجة يمكن أن يكون بالإضافة إلى ذلك ملطخة تولويدين الأزرق. أخذت صور ثوراسيس كاملة في 10 X وكان كمياً منطقة العضلات بيناريزينج الصور (من أبعاد متساوية) والتحديد الكمي للنسبة المئوية المقابلة لانسجة العضلات (بكسل سوداء) من أصل المجموع، مع برنامج إيماجيج بكسل.
التعديلات على مخاليط إعداد وتثبيت الأنسجة، كالزيادة في تركيز حل4 و glutaraldehyde أوسو، وعرض في هذا البروتوكول، يسمح الحفاظ على فريدة من نوعها لانسجة العضلات. يرجع ذلك إلى أن يتجنب البروتوكول بالتدهور وتشوه النسيج، مما يجعل التحليل اللاحق للعينات أكثر موثوقية حتى في ظروف شديدة ضامر المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية العضلية مثل ضمور ميوتونيك (ألماني). في شكله أكثر شيوعاً، ومارك ألماني من النوع 1، جلبت هذه الاضطرابات الوراثية النادرة يكرر CUG الموسع في نصوص الضمور myotonic البروتين كيناز (دمبك). الجيش الملكي النيبالي دمبك متحولة المجاميع البؤر ريبونوكلير النموذج الذي عزل البروتينات ربط الحمض النووي الريبي النووي مثل موسكليبليند (MBNL1-3؛ 6من موسكليبليند (Mbl) في المورفولوجية). أننا إنشاء نموذج المورفولوجية “الضمور ميوتونيك” بالإعراب عن 250 CTG يكرر تحت المروج سلسلة ثقيلة العضلات الميوسين (Mhc-Gal4). نموذج الذباب كانت يطير مع النمط الظاهري نموذجي ‘عقدت حتى أجنحة’ وخطيرة عضلة ضمور في هذه إيفمس (الشكل 2). وأظهرت الدراسات السابقة التي أجريت في المختبر أن تصميم منطقة العضلات إيفمس طريقة موثوقة قياس آثار المعدلات الكيميائية أو الوراثية المختلفة من ضمور العضلات في هذه الذباب النموذجي7. وكمثال على ذلك، تحقق overexpression isoform Mbl ج في الذباب معربا عن 250 CTG يكرر في العضلات، إنقاذ منطقة العضلات، كما يتم استنفاد Mbl بعزل العامل المسبّب في DM1 المرضية8 (الشكل 2). كما تم إنقاذ منطقة العضلات بعد تغذية نموذج مارك ألماني الذباب مع Abp1، هيكسابيبتيدي مع DM1 مكافحة ثبت النشاط9 (الشكل 2D).
رقم 2. التحديد الكمي للمقاطع دورسوفينترال من ثوراسيس الكبار جزءا لا يتجزأ من الراتنج. العضلات الرحلات غير المباشرة (أ-د) من melanogaster المورفولوجية الوراثية ذات الصلة المشار إليها. (أ) مراقبة الذباب (yw). (ب) التعبير عن 250 غير الترميز CTG يكرر في العضلات (UAS-CTG(250)x) تسبب انخفاض منطقة العضلات في دلمس بالمقارنة مع مراقبة الذباب. (ج) هذا النمط الظاهري ضمور العضلات قد انقذته overexpression موسكليبليند (MblC) (UAS-CTG (250) × UAS-MblC) و (د) تغذية الذباب النموذجي مع هيكسابيبتيدي Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). في جميع الصور الجانب الظهرية في الأعلى. كانت مدفوعة المتسلسلات العضلات باستخدام أحد المروجين ثقيلة-سلسلة الميوسين (Mhc)-Gal4. (ه) التحديد الكمي للنسبة المئوية لمساحة العضلات بالنسبة للذباب التحكم أكدت أن الخلافات كانت كبيرة. ويبين الرسم البياني وسائل ± S.E.M. * *ف< 0.01 و * ف < 0.05 (الاختبار t Student´s). شريط الحجم: 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الطريقة التي ذكرت هنا سوف تكون موضع اهتمام الباحثين تركز على تنمية العضلات وصيانة، والشيخوخة، وباثولوجيا المرض واختبار المخدرات كما أنها توفر معلومات موثوقة حول كيفية استجابة أنسجة العضلات للعوامل الداخلية والخارجية على حد سواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت أن melanogaster المورفولوجية هو نموذج مفيد لدراسة الأمراض العصبية العضلية البشرية7،10،11، بما في ذلك “ضمور ميوتونيك”، التي تتميز بمظهر ضمور العضلات. البروتوكول المعروضة هنا أداة مفيدة للتحديد الكمي لضمور العضلات الناجم عن ظهور أو ت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر أعضاء متعدية الجينوميات المجموعة وكاثرين ي هانسون للتغذية المرتدة والتحسينات التي أدخلت على هذا البروتوكول. نفذ هذا المشروع بمنحه بحثية SAF2015-64500 آر، الذي يشمل “صناديق التنمية الإقليمية الأوروبية” ومنحته وزارة دي ايكونوميا y كومبيتيتيفيداد R.A.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
