Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren
Summary
Wij rapporteren een methode om te kwantificeren spier gebied, dat een indirecte methode is om spiermassa in Drosophila volwassenen. We laten zien dat de toepassing van onze methodologie door het analyseren van de indirecte vlucht spieren in een Drosophila model van myotone dystrofie ziekte.
Abstract
Spiermassa verspillen, is bekend als spieratrofie, een gemeenschappelijk fenotype in Drosophila modellen van neuromusculaire ziekten. We hebben gebruik gemaakt van de indirecte vlucht spieren (IFMs) van vliegen, specifiek de dorso-longitudinale spieren (DLM), als de experimentele onderworpen aan maatregel het atrofische fenotype door verschillende genetische oorzaken teweeggebracht. In dit protocol, beschrijven we hoe te verankeren vliegen thorax spieren voor halve dunne segmenteren, het verkrijgen van een goed contrast tussen spieren en het omringende weefsel en hoe optische Microscoop afbeeldingen voor halfautomatische verwerving van meetbare gegevens wilt verwerken en analyse. We beschrijven drie specifieke toepassingen van de methodologische pijpleiding. Ten eerste, laten we zien hoe de methode kan worden toegepast om te kwantificeren spier degeneratie in een vlieg model van myotone dystrofie; Ten tweede, meting van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier kan helpen bij het identificeren van genen die bevorderen of voorkomen spieratrofie en/of degeneratie van de spier; Ten derde, dit protocol kan worden toegepast om te bepalen of een kandidaat-verbinding kunnen aanzienlijk wijzigen een bepaald atrofische fenotype geïnduceerd door een ziekte-veroorzakende mutatieof door een milieu-trigger.
Introduction
De thorax van de fruitvlieg bevat twee verschillende klassen van de vlucht spieren, die functioneel, fysiologisch en anatomisch onderscheiden zijn. Deze spieren zijn: de indirecte vlucht spieren (IFM), die zijn samengesteld uit dorso-longitudinaal (DLM) en dorso-ventrale (DVM) spieren (Figuur 1), en de synchrone vlucht controle spieren1,2. Deze spieren genereren samen de verhoogde mechanische kracht nodig is voor de vlucht. De grootte, de distributie en de rostro-caudal vervreemding van de IFMs toestaan een gemakkelijke oriëntatie voor transversale vectorafbeeldingsbestanden3 (figuur 2A). Om deze reden hebben wij deze spieren te bestuderen spieratrofie bij Drosophila melanogastergeselecteerd.
Figuur 1. Diagram van de thorax van de fruitvlieg tonen de indirecte vlucht spieren (IFMs) regeling. (Links) geeft een laterale weergave en (rechts) geeft een dwarsdoorsnede van de thorax. De IFMs zijn samengesteld uit de Dorso-longitudinaal (DLM) spieren (in rood) en de (DVM) Dorso-ventrale spieren (in groen).
Behoud van weefsel structuur en de controle over dorso-ventrale as oriëntatie van histologische secties zijn cruciaal voor het garanderen van adequate beoordeling van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de spier. Voor het behoud van de bespiering die we een mengeling van de fixatie van Tomlinson et al. gewijzigd gebruikt 4 . Bovendien, omdat de spieren zijn interne weefsels, de ondoordringbaarheid van Drosophilaexoskelet is een probleem als fixatie mengsels niet kunnen tot de doel-weefsels doordringen. Om te omzeilen van dit probleem, verwijderd we het vliegen hoofd, benen, vleugels en de laatste twee segmenten van de buik maken van gaten waardoor de fixatie mengsel in te voeren. Als onderdeel van het protocol van de fixatie dat we behandeling met osmium tetroxide (OsO4)5, waarin uitvoerig wordt gebruikt vanwege de mogelijkheid om op te lossen van vetten opgenomen, met inbegrip van triglyceriden. OsO4 behoudt de meeste structuren zeer goed, met name op de cytologische niveau en tegelijkertijd geeft contrast aan de afbeelding. Na fixatie, werden Drosophila thoraces ingesloten in hars voor transversale semi-dun vectorafbeeldingsbestanden (1,5 µm). Voor verbeterd contrast, kan weefsel worden bovendien gekleurd met toluïdine blauw. Beelden van de volledige thoraces werden genomen op 10 X en spier gebied werd gekwantificeerd door de binarizing van beelden (van gelijke afmetingen) en kwantificeren van percentage van pixels overeenkomt met spierweefsel (zwarte pixels) uit totaal, met ImageJ software.
Wijzigingen op het weefsel voorbereiding en fixatie mengsels, als de stijging van de concentratie van OsO4 en Glutaaraldehyde oplossing, geïntroduceerd in dit protocol toegestaan unieke behoud van spierweefsel. Dit is omdat het protocol vermijdt de afbraak en vervorming van het weefsel, waardoor de achterste analyseresultaten van de monsters betrouwbaarder zelfs in hoogst atrofische voorwaarden in verband met neuromusculaire degeneratieve ziekten zoals myotone dystrofie (DM). In zijn meest voorkomende vorm, DM type 1, wordt deze zeldzame genetische aandoening veroorzaakt door uitgebreide CUG herhalingen in Transcripten myotone dystrofie proteïne kinase (DMPK). Mutant DMPK RNA aggregaten formulier ribonuclear foci die sekwestreren van de Muscleblind-achtige nucleaire RNA-bindende proteïnen (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. We genereerden een Drosophila model van myotone dystrofie met het uitspreken van 250 CTG herhalingen onder de gespierde myosin zware ketting promotor (Mhc-Gal4). Model vliegen werden loopvogel met een typische ‘up-gehouden wings’ fenotype en had ernstige spier atrofie in hun IFMs (figuur 2B). Eerdere studies uitgevoerd in ons laboratorium hebben aangetoond dat de bepaling van het oppervlak van de spier van IFMs is een betrouwbare methode om te kwantificeren van de effecten van verschillende chemische of genetische parameters van de spieratrofie in deze model vliegen7. Als voorbeeld bereikt overexpressie van Mbl isovorm C in vliegen uitdrukken van de 250 CTG in de spier herhaalt, een redding van spier gebied, zoals Mbl uitputting door sekwester is de activerende factor in DM1 pathogenese8 (figuur 2C). Spier gebied werd ook gered na het voeden van de DM-model vliegt met Abp1, een hexapeptide met bewezen anti-DM1 activiteit9 (figuur 2D).
Figuur 2. Kwantificering van dorsoventral secties van volwassen thoraces hars ingesloten. (A-D) indirecte vlucht spieren van Drosophila melanogaster met de aangegeven relevante genotypen. (A) controle vliegt (yw). (B) uitdrukking van 250 niet-coderende CTG herhaalt in de spier (UAS-CTG(250)x) veroorzaakt een vermindering van de spier gebied in DLMs in vergelijking met controle vliegen. (C) deze spier atrofie fenotype werd gered door overexpressie van Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) en (D) voeden de model vliegen met de hexapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). In alle afbeeldingen is de dorsale zijde op bovenkant. Transgenen werden verdreven naar de spier met behulp van een Myosin zware-keten promotor (Mhc)-Gal4. (E) de kwantificering van percentage van de spier ten opzichte van de controle vliegen bevestigd dat de verschillen significant waren. Het histogram geeft middelen ± S.E.M. **p< 0.01 en * p < 0.05 (Student´s t-test). Schaal bar: 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De methode die hier gemeld zullen van belang aan onderzoekers zich te concentreren op de spierontwikkeling, onderhoud en veroudering, ziekte pathologie en drug testen want het biedt betrouwbare informatie over hoe spierweefsel op zowel de externe als de endogene factoren reageert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is aangetoond dat Drosophila melanogaster een nuttig model is te bestuderen van neuromusculaire ziekten bij de mens7,10,11, met inbegrip van myotone dystrophie, die worden gekenmerkt door het verschijnen van musculaire atrofie. Het protocol hier gepresenteerd is een nuttig instrument voor het kwantificeren van de degeneratie van de spieren veroorzaakt door het ontstaan of de progressie van een bepaalde ziekte in een…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank leden van de translationeel genomica en Kathryn J Hanson voor de feed-back en de verbeteringen op dit protocol. Dit project werd uitgevoerd met onderzoeksbeurs SAF2015-64500-R, waarin de Europese regionale ontwikkelingsfondsen, toegekend aan R.A door het Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
