Optisk tværsnit muskel område bestemmelse af Drosophila Melanogaster voksen indirekte flyvning muskler
Summary
Vi rapporterer en metode til at kvantificere muskel område, som er en indirekte metode til at bestemme muskelmasse i Drosophila voksne. Vi demonstrere anvendelsen af vores metodik ved at analysere den indirekte flyvning musklerne i Drosophila model af født dystrofi sygdom.
Abstract
Muskelmasse spilde, er kendt som muskelatrofi, en fælles fænotype i Drosophila modeller af neuromuskulære sygdomme. Vi har brugt de indirekte flyvning muskler (IFMs) af fluer, specielt de dorso-langsgående muskler (DLM), som den eksperimentelle under foranstaltning atrofisk fænotype som følge af forskellige genetiske årsager. I denne protokol, vi beskriver hvor hen til indkapsle flyve thorax muskler for semi tynde skæring, hvordan du kan få en god kontrast mellem muskel og det omgivende væv og sådan behandle optisk mikroskop billeder for semiautomatisk erhvervelse af kvantificerbare data og analyse. Vi beskriver tre specifikke anvendelser af metodologiske rørledningen. Først, vi viser, hvordan metoden kan anvendes til at kvantificere muskel degeneration i født dystrofi flyve model. andet, måling af muskel tværsnitsareal kan hjælpe med at identificere gener, der enten fremmer eller forhindrer muskelatrofi og/eller muskel degeneration; for det tredje, denne protokol kan anvendes til at afgøre, om en kandidat sammensatte er købedygtig væsentligt ændre en given atrofisk fænotype induceret af en sygdomsfremkaldende mutationeller af en miljømæssige udløser.
Introduction
Thorax af frugtflue indeholder to forskellige klasser af flyvningen muskler, som er funktionelt, fysiologisk og anatomisk adskilte. Disse muskler er: indirekte flyvning musklerne (IFM), som er sammensat af dorso-langsgående (DLM) og dorso-ventrale (DVM) muskler (figur 1) og synkrone flyvningen kontrollere musklerne1,2. Disse muskler skabe sammen den forhøjede mekaniske strøm, der kræves for flyvningen. Størrelse, distribution og rostro-caudale disponeringen af IFMs tillader en nem orientering for tværgående skæring3 (figur 2A). Derfor har vi valgt disse muskler til at studere muskelatrofi i Drosophila melanogaster.
Figur 1. Diagram af thorax af frugtflue viser de indirekte flyvning muskler (IFMs) arrangement. (Venstre) repræsenterer en lateral udsigt og (til højre) repræsenterer et tværsnit af brystkassen. IFMs er sammensat af Dorso-langsgående (DLM) muskler (i rødt) og Dorso-ventrale (DVM) muskler (i grønt).
Bevarelse af væv struktur og kontrol over dorso-ventrale akse orientering af histologiske sektioner er afgørende for at sikre korrekt vurdering af muskel tværsnitsareal. At bevare muskelstruktur vi brugte en fiksering blanding ændret fra Tomlinson et al. 4 . Desuden, fordi musklerne er indre væv, uigennemtrængelighed af Drosophilaexoskeleton er et problem som fiksering blandinger ikke kan trænge igennem til målvæv. For at omgå dette problem, vi har fjernet den flyve hoved, ben, vinger og de sidste to segmenter af maven til at skabe huller, der tillod fiksering blandingen ind. Som en del af fiksering protokollen vi inkluderet behandling med osmium dinitrogentetraoxid (OsO4)5, som er flittigt brugt på grund af dens evne til at løse fedtstoffer, herunder triglycerider. OsO4 bevarer de fleste strukturer ekstremt godt, især på den cytologiske niveau og samtidig står i kontrast til billedet. Efter fiksering, var Drosophila thoraces indkapslet i harpiks for tværgående semi-tynd skæring (1,5 µm). For forbedret kontrast, kan væv desuden farves med toluidin blå. Billeder af komplet thoraces blev taget på 10 X og muskel område var kvantificeres ved binarizing billeder (af samme dimensioner) og kvantificere procentdel af pixels svarende til muskelvæv (sort pixel) af i alt, med ImageJ software.
Ændringer på væv forberedelse og fiksering blandinger, som forøgelse af koncentrationen af OsO4 og glutaraldehyd løsning, indført i denne protokol, tilladt unikke bevarelse af muskelvæv. Dette skyldes, at protokollen undgår forringelse og deformation af væv, gøre den posteriore analyse af prøverne mere pålidelige selv under meget atrofisk forhold forbundet med neuromuskulære degenerative sygdomme såsom født dystrofi (DM). I sin mere almindelige form, DM type 1, er denne sjældne genetiske lidelse forårsaget af udvidet LBC gentagelser i født dystrofi protein kinase (DMPK) udskrifter. Mutant DMPK RNA aggregater form ribonuclear foci, at udskille Muscleblind-lignende nukleare RNA-bindende proteiner (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) i Drosophila)6. Vi genereret en Drosophila model af født dystrofi udtrykke 250 CTG gentager muskuløs myosin heavy chain promotor (Mhc-Gal4). Model fluer var flightless med en typisk ‘op-holdt vinger’ fænotype og havde alvorlig muskel atrofi i deres IFMs (figur 2B). Tidligere undersøgelser udført i vores laboratorium har vist, at bestemmelsen af muskel arealet af IFMs er en pålidelig metode til at kvantificere virkningerne af forskellige kemiske eller genetisk modificering af muskelatrofi i disse model flyver7. Som forbillede opnåede overekspression af Mbl isoform C i fluer udtrykker de 250 CTG gentager i musklen, en redning af muskel område, som Mbl udtynding af binding er den udløsende faktor i DM1 patogenese8 (figur 2 c). Muskel område blev også reddet efter fodring DM model flyver med Abp1, en hexapeptide med dokumenteret anti-DM1 aktivitet9 (figur 2D).
Figur 2. Kvantificering af dorsoventral dele af harpiks-embedded voksne thoraces. (A-D) indirekte flyvningen muskler af Drosophila melanogaster med de anførte relevante genotyper. A kontrol flyver (yw). (B) udtryk for 250 ikke-kodende CTG gentager i muskel (UAS-CTG(250)x) forårsaget en reduktion af muskel areal i DLMs i forhold til kontrol fluer. (C) denne muskel atrofi fænotype blev reddet af overekspression af Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) og (D) fodring model flyver med hexapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). I alle billeder er den dorsale side på toppen. Transgener blev drevet til muskel ved hjælp af en Myosin heavy chain promotor (Mhc)-Gal4. (E) kvantificering af procentdel af muskel område i forhold til kontrol fluer bekræftet, at forskellene var betydelig. Histogrammet viser middel ± S.E.M. **p< 0,01 og * p < 0,05 (Student´s t-test). Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Metoden her rapporteret vil være af interesse for forskere med fokus på muskel udvikling, vedligeholdelse og aldring, sygdom patologi og test af lægemidler, da det giver pålidelige oplysninger om, hvordan muskelvæv reagerer på både endogene og eksterne faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er blevet påvist, at Drosophila melanogaster er en nyttig model til at studere menneskets neuromuskulære sygdomme7,10,11, herunder født Dystrophies, som er karakteriseret ved fremkomsten af muskelatrofi. Protokollen præsenteres her er et nyttigt værktøj for kvantificering muskel degeneration forårsaget af debut eller progression af en bestemt sygdom i en flyve model. For eksempel, er det også muligt at følg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af translationel genomforskning gruppe og Kathryn J Hanson for feed-back og forbedringerne på denne protokol. Dette projekt blev udført med forskning tilskud SAF2015-64500-R, som omfatter europæiske regionale Udviklingsfond, tildeles Odins af Ministerio de Economia y Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
