腎臓蛋白質の非ウイルス性発現の流体力学的腎盂注入
Summary
このプロトコルでは、具体的には腎臓における導入遺伝子発現を生成する腎盂を介してマウス腎臓にプラスミド DNA を注入する方法をについて説明します。
Abstract
流体の注入は、プラスミド DNA や他の物質と様々 な組織を使ってローカル、高圧環境を作成します。流体尾静脈注射、たとえば、肝臓を導入することができます確立された方法です。この原稿では、マウス腎臓腎臓特異的遺伝子発現のプラスミド DNA の直接注入による流体力学的原則の適用について説明します。マウスを麻酔し、腎臓、腎盂に直接プラスミド DNA 含有溶液の高速注入が続いて側腹部切開によって公開されています。針は 10 秒の場所に保管し、切開部位を縫合します。次の日、ライブ動物イメージング、遺伝子発現を測定するために使用可能性があります西部のしみまたは免疫組織化学または興味の蛋白質の検出選択の遺伝子に適した他のアッセイを使用します。遺伝子発現を延長する公開されたメソッドには、遺伝子に免疫応答を抑制するトランスポゾンを介した遺伝子統合およびシクロフォスファミド治療が含まれます。
Introduction
流体の尾静脈注入法マウス肝1,2遺伝子発現の高いレベルを達成するために一般的に使用される方法となっています。腎臓は、はるかに低いレベル、約 100 以下3でこの手法によっても transfected します。ここで説明した流体力学的腎盂インジェクションは肝4,5 以前確立されている同じ流体力学的原則を使用して物理的な手段によってオルガン式の特異性を制御する簡単な方法を提供します。、筋肉6、および他の器官7,8。このメソッドは、圧力を使用して、生きた動物体内で細胞を transfects し、同時に、すぐに臓器への損傷を誘発する細胞に含まれている DNA の流体を強制的にスピード解決9。インスリン注射器で注射と一緒に逃げ面切開10を介して腎臓を視覚化する確立された手技を使用して、さまざまな種類の腎臓の細胞、主に間質細胞の成功したトランスフェクションを発見しました。細管と収集の管11。これらのマウスの解剖は、他の臓器がイメージング テクニック11ルシフェラーゼによる可視化するのに十分高いレベルでトランスフェクションいないことを示しています。技術は非ウイルス性なので、transfection のためプラスミッド DNA の使用は注入に必要な試薬を高速かつ簡単に準備を許可します。
抗酸化物質グルタチオン S トランスフェラーゼ A4、インスリン様成長因子-1 受容体と期待される生物学的効果11,とすべての腎臓のホルモンのエリスロポエチンを表現するのにローカライズされた流体の注射を使用しています。12,13。 プロモーター選択 DNA 投与量、注入量の管理のルートの詳細な評価が実行される11をされています。さらに、両方piggyBacトランスポゾン システムおよび/またはシクロホスファミド治療遺伝子を免疫反応を抑制するためは、長期的な遺伝子発現の結果11を改善するために示されています。他の研究者は、1 ヶ月14より大きいの期間の高いトランスフェクション効率を達成する成功をラット腎静脈アプローチを使用しています。しかし、人間の病気を模倣した表現型の遺伝的補正通常実行されますマウスの最初概念実証として以来、ほとんどの哺乳類の遺伝学的モデルは、マウス モデル。我々 は腎静脈注射腎盂注入を比較し、腎盂への注入が遺伝子発現 (約 10 倍高い) と生存11腎静脈よりも優れていたことを発見します。腎盂は腎臓への参入の理想的なルートは、尿の生産の変動を許容する柔軟性が、水腎症の間に拡張した場合でもその構造の整合性を維持することがしばしばです。また、腎盂への注入は、野末注入より腎臓によって保持される目に見えないに体液が注入された腎被膜のピアスをせず腎臓へのアクセスを許可しました。他のマウスの臓器、血管以外のエントリのルートを持っていないが、腎臓の尿の空間は理想的な注射。また、腎静脈への注射は腹腔内に血液の漏れになりました。野生型マウスの腎臓の全腎容積単一の腎臓のボリュームは流体によって腎盂流体注入量とほぼ等しいので、約 0.2 cm3、磁気共鳴画像と推定されています注入 (100 μ L)15。ここで、利用可能にした腎臓の再現可能なトランスフェクションを達成するために流体力学的腎盂注入プロトコルの詳細なニュアンスのすべて。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、腎臓における具体的に再現性のある遺伝子発現を達成するための手法を説明します。適度に経験豊富な外科医の手の中、我々 はマウスの年齢に応じて、50-100% の範囲で遺伝子の読み出しの感度であるためこの手法で導入したマウスの割合を発見しました。ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、トランスポゾンpiggyBacを受信マウスの数ヶ月は、背景の上、受信同?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.E.W. および健康の国民の協会 [R01 DK095867] キャリア開発賞から復員部の [BX002797] がサポートされており、米国心臓協会 [15GRNT25700209] サポート j. c.健康の国民の協会 [DK093660]、復員軍人援護局の部 [BX002190] およびヴァンダービルト腎臓病センター サポート M.H.W.この資料は、VA テネシー州の谷の医療系施設のリソースとサポート作業の結果です。
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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