Гидродинамические почечной лоханки инъекции для выражения-вирусных белков в почках
Summary
Этот протокол описывает метод придать плазмидной ДНК в мыши почки через почечной лоханки производить трансген выражение специально в почках.
Abstract
Гидродинамические инъекции создает местные, высокого давления среды для transfect различных тканей с плазмида ДНК и других веществ. Гидродинамические хвост инъекции Вену, например, является устоявшейся метод, по которому можно transfected печени. Эта рукопись описывает приложение гидродинамических принципов путем инъекций почки мыши непосредственно с плазмидной ДНК для экспрессии генов почек конкретных. Наркоз мышей и почки предоставляемые фланг разрез, следуют быстро инъекции плазмида ДНК содержащих решения непосредственно в почечной лоханки. Игла хранится в месте десять секунд и сайт разрез зашивается. Следующий день, живут животных изображений, Западная помарка, или иммуногистохимия могут использоваться для анализа экспрессии генов, или другие анализы, подходит для трансген выбора используются для обнаружения протеина интереса. Опубликованные методы продлить экспрессии генов включают трансген, transposon опосредованной интеграции и циклофосфамида лечения подавлять иммунный ответ трансген.
Introduction
Техника инъекции Вену гидродинамических хвост стал часто используемым способом для достижения высоких уровней экспрессии генов в мыши печени1,2. Почки являются также transfected на этот метод на гораздо более низком уровне, около 100-кратного меньше3. Инъекции гидродинамических почечной лоханки, описанные здесь обеспечивает простой способ для контроля специфика органа выражения через физические средства, используя те же гидродинамических принципы, которые были установлены ранее в печени4,5 , мышцы6и7,других органов8. Этот метод transfects клеток в живых животных в естественных условиях с помощью давления и скорость, чтобы заставить жидкости содержащие ДНК в клетки, одновременно вызывающих повреждения органа, который быстро решены9. Использование устоявшихся хирургические методы для визуализировать почки через разрез фланге10 наряду с одной инъекции инсулина шприц, мы нашли успешных трансфекции различных типов клеток почек, главным образом интерстициальных фибробластов, трубочки и собирая протока11. Рассечение этих мышей показало, что другие органы являются не transfected на уровнях достаточно высока, чтобы визуализировать Люцифераза изображений техники11. Поскольку метод не вирусная, использование плазмидной ДНК для transfection позволяет быстро и легко Подготовка реагентов, необходимых для инъекций.
Мы использовали локализованных гидродинамических инъекции выразить антиоксидант глутатион S-трансферазы A4, инсулин подобный фактор роста-1 рецептор и гормона эритропоэтина в почках, все с ожидаемые биологические эффекты11, 12 , 13. подробную оценку маршрут администрации, объем впрыска, дозировка ДНК и промоутер выбор был выполненных11. Кроме того оба piggyBac transposon системы и/или циклофосфамида лечения для подавления иммунной реакции трансген было показано, улучшить долгосрочные ген выражение результатов11. Другие исследователи использовали подход почечных вен в Крыса с успехом, достижение высоких трансфекции эффективности для периодов времени более чем один месяц14. Однако генетической коррекции фенотипов, имитируя человека болезни обычно выполняются в мышах сначала как доказательства в концепция так как наиболее млекопитающих генетической модели мыши модели. Мы по сравнению почечных вен инъекции инъекции почечной лоханки и обнаружил, что инъекции в почечной лоханки превосходит почечных вен для экспрессии генов (приблизительно в десять раз выше) и выживания11. Почечной лоханки это идеальный маршрут вступления в почках, потому что это достаточно гибким, чтобы терпеть колебания в производство мочи и часто способен поддерживать свою структурную целостность, даже когда расширены во время гидронефроз. Кроме того инъекции в почечной лоханки разрешен доступ к функции почек без пирсинга капсулу почки, позволяя закачиваемой жидкости для удерживаются заметно лучше, чем инъекции intraparenchymal почек. Другие мыши органов не имеют маршрут входа помимо сосудистую, но мочи пространство почек является идеальным укола. Кроме того инъекции в Вену почечной привели к утечки крови в брюшной полости. Объем всего почки почек одичал тип мыши была оценена магнитно-резонансной томографии быть приблизительно 0,2 см3, поэтому объем одной почки примерно равное количество жидкости вводят лоханочных гидродинамических 15инъекций (100 мкл). Здесь мы сделали доступными все подробную нюансы гидродинамических почечной лоханки инъекции протокола для достижения воспроизводимых трансфекции почки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описывается надежный метод для достижения экспрессии генов воспроизводимые специально в почках. В руках умеренно опытный хирург мы нашли процент transfected на эту технику, чтобы быть в диапазоне 50-100%, в зависимости от возраста мыши и чувствительность индикация трансген мы?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Премию развития карьеры от Департамента по делам ветеранов [BX002797] поддерживает L.E.W. и национальных институтов здравоохранения [R01-DK095867] и Американской ассоциации сердца [15GRNT25700209] ж.к. Поддержка национальных институтов здравоохранения [DK093660], Департамент по делам ветеранов [BX002190] и Вандербильта центр по болезни почек M.H.W. Этот материал является результатом работы поддерживаемых ресурсов и использования объектов в системе здравоохранения долины ва Теннесси.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
