Iniezione idrodinamica pelvi renale per Non virali espressione delle proteine nel rene
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per iniettare DNA plasmidico in rene del mouse tramite la pelvi renale per produrre l’espressione del transgene in particolare nel rene.
Abstract
Iniezione idrodinamica crea un ambiente locale, ad alta pressione di transfect vari tessuti con il DNA del plasmide ed altre sostanze. Iniezione della vena della coda idrodinamica, ad esempio, è un metodo ben stabilito che il fegato può essere transfected. Questo manoscritto descrive un’applicazione di principi idrodinamici per iniezione del rene del mouse direttamente con il DNA del plasmide per l’espressione genica del rene-specifica. Topi sono anestetizzati e rene è esposto da un’incisione del fianco seguita da una rapida iniezione di una soluzione contenente DNA plasmidico direttamente nella pelvi renale. L’ago è mantenuto sul posto per dieci secondi e il sito di incisione viene suturato. Il giorno seguente, immagini animali dal vivo, Western blot, o immunohistochemistry può essere usato per analisi di espressione genica o altri dosaggi adatti per il transgene di scelta vengono utilizzati per il rilevamento della proteina di interesse. Metodi pubblicati per prolungare l’espressione genica comprendono trattamento di integrazione e ciclofosfamide transgene transposon-mediata per inibire la risposta immunitaria per il transgene.
Introduction
La tecnica di iniezione della vena della coda idrodinamica è diventato un modo comunemente usato per raggiungere elevati livelli di espressione genica nei mouse del fegato1,2. I reni sono anche trasfettati con questa tecnica ad un livello più basso, circa 100 volte meno3. L’iniezione idrodinamica pelvi renale descritto qui fornisce un modo semplice per controllare la specificità di espressione organo attraverso mezzi fisici utilizzando gli stessi principi idrodinamici che sono stati stabiliti in precedenza nel fegato4,5 , muscolo6e altri organi7,8. Questo metodo transfects cellule in animali vivi in vivo mediante pressione e velocità per forzare il fluido contenente DNA nelle cellule, allo stesso tempo inducendo danni all’organo che è rapidamente risolto9. Usando le tecniche chirurgiche consolidate per visualizzare il rene attraverso un’ incisione di fianco10 insieme con una singola iniezione con una siringa di insulina, abbiamo trovato successo transfezione di vari tipi di cellule renali, principalmente interstiziale fibroblasti, tubuli e raccolta del condotto11. Dissezione di questi topi ha dimostrato che altri organi non transfected a livelli abbastanza in alto per visualizzare di luciferasi11di tecniche di imaging. Poiché la tecnica è non-virale, uso del DNA del plasmide per la transfezione permette facile e veloce preparazione dei reagenti necessari per l’iniezione.
Abbiamo usato iniezioni localizzate di idrodinamiche per esprimere l’antiossidante glutatione S-transferasi A4, il recettore del fattore di crescita 1 insulino-simile e l’eritropoietina dell’ormone nel rene, tutte dotate di effetti biologici previsti11, 12 , 13. valutazione dettagliata della via di somministrazione, volume di iniezione, dosaggio di DNA e la scelta del promotore è stata effettuata11. Inoltre, entrambi i piggyBac trasposone sistema trattamento e/o ciclofosfamide per sopprimere la reazione immunitaria per il transgene hanno dimostrato di migliorare i risultati a lungo termine espressione di gene11. Altri ricercatori hanno utilizzato un approccio della vena renale nel ratto con successo, raggiungere la transfezione alta efficienza per periodi di tempo superiori a un mese14. Tuttavia, correzione genetica dei fenotipi che imita la malattia umana vengono solitamente eseguiti in topi prima come un proof-of-concept poiché modelli genetici più mammiferi sono modelli murini. Abbiamo confrontato ad iniezione della vena renale alla pelvi renale iniezione e trovato che iniezione nella pelvi renale era superiore alla vena renale per l’espressione genica (circa dieci volte superiore) e sopravvivenza11. La pelvi renale è un percorso ideale di entrata nel rene, perché è abbastanza flessibile da tollerare fluttuazioni della produzione di urina e spesso è in grado di mantenere la sua integrità strutturale anche quando dilatato durante idronefrosi. Inoltre, iniezione nella pelvi renale consentito l’accesso al rene senza perforare la capsula del rene, permettendo il visibilmente trattenuto dal rene meglio di intraparenchymal iniezione del fluido iniettato. Altri organi del mouse non si dispone di un percorso di ingresso diverso da quello del sistema vascolare, ma lo spazio urinario del rene è un sito di iniezione ideale. Inoltre, iniezione nella vena renale ha provocato perdite di sangue nella cavità addominale. Il volume totale del rene dei reni di selvaggio-tipo di mouse è stato stimato dalla risonanza magnetica per essere circa 0,2 cm3, quindi il volume di un singolo rene è approssimativamente uguale alla quantità di liquido iniettato dal bacino renale idrodinamico iniezione (100 µ l)15. Qui, abbiamo messo a disposizione tutte le sfumature dettagliate del protocollo iniezione idrodinamica pelvi renale per raggiungere transfezione riproducibile del rene.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per la realizzazione di espressione genica riproducibile in particolare nel rene. Nelle mani di un chirurgo esperto moderatamente abbiamo trovato la percentuale dei topi transfettati con questa tecnica per essere nella gamma di 50-100%, a seconda dell’età del mouse e la sensibilità di lettura del transgene. Il livello di espressione di gene della luciferasi era sopra priorità bassa per parecchi mesi in topi che ricevono piggyBac trasposoni e completamente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il Career Development Award dal Department of Veterans Affairs [BX002797] supportati L.E.W. e il National Institutes of Health [R01-DK095867] e American Heart Association [15GRNT25700209] supportati J.C. Il National Institutes of Health [DK093660], Department of Veterans Affairs [BX002190] e centro del Vanderbilt per la malattia renale supportati M.H.W. Questo materiale è il risultato di lavoro sostenuto con risorse e utilizzo di servizi VA Tennessee Valley Healthcare System.
Materials
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic – Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia – Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch – 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads – 15" x 21" – need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic – Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT – QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
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