تقييم عملية الهجرة وغزو الخلية: مقارنة من الصفر فيديو المستندة إلى مجهر الجرح المقايسة والمقايسة الدائرة Boyden
Summary
تفيد هذه الدراسة أسلوبين مختلفين لتحليل الخلية الغزو والهجرة: مقايسة الدائرة Boyden و في المختبر الفيديو المستندة إلى مجهر التئام المقايسة. وصف بروتوكولات لهذه التجارب اثنين، وتتم مقارنة مزايا وعيوب.
Abstract
قدرات الخلايا السرطانية الغزو والهجرة هي المساهمة الرئيسية في تطور السرطان والتكرار. العديد من الدراسات استكشاف قدرات الهجرة وغزو لفهم كيفية نشر الخلايا السرطانية، بهدف وضع استراتيجيات جديدة للعلاج. التحليل الأساس الخلوية والجزيئية لهذه القدرات قد أدى إلى توصيف الحراك الخلية والخصائص الفيزيائية الكيميائية سيتوسكيليتون والخلوية المكروية. لسنوات عديدة، كانت المقايسة الدائرة Boyden والمقايسة الجرح الصفر التقنيات القياسية لدراسة الخلية الغزو والهجرة. ومع ذلك، هذه التقنيات اثنين على قيود. والرزن الدائرة Boyden صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً، والمقايسة الجرح الصفر بإمكانية تكرار نتائج منخفضة. تطوير التكنولوجيات الحديثة، لا سيما في الفحص المجهري، زادت إمكانية تكرار نتائج لفحص الجرح الصفر. استخدام نظم تحليل قوي، يمكن استخدام مجهر فيديو “في حاضنة” تقديم تحليل في الوقت الحقيقي والتلقائي للهجرة الخلية والغزو. الهدف من هذه الورقة هو تقرير ومقارنة فحوصات اثنين المستخدمة في دراسة الخلية الغزو والهجرة: مقايسة الدائرة Boyden وأمثل في المختبر فيديو المستندة إلى مجهر الصفر الجرح المقايسة.
Introduction
غزو الخلية والهجرة تشارك في نشر الخلايا السرطانية، التي هي السبب الرئيسي لمقاومة للعلاج1 ويمكن أن تؤدي إلى لوكوريجيونال أو تكرار المنتشر بعد علاج السرطان2. المرحلة الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) هو عملية الهجرة غزو الخلية فيها السرطان في خلايا التبديل من الظهارية إلى النمط الظاهري الوسيطة الأولى. ﻫ-كادهيرين علامة خارج الخلية الظهارية النمط الظاهري3، والتعبير زيادة N-كادهيرين وفيمنتين من سمات النمط الظاهري الوسيطة4. الهجرة يتوقف أيضا على قدرة الخلايا السرطانية المتأصلة لغزو المصفوفة خارج الخلية (ECM) من خلال عمل مصفوفة ميتالوبروتيسيس5.
لقد وصف هذا الغزو – الهجرة وآلية للسرطان في العديد من المواقع، لا سيما في سرطان الرأس والرقبة6. وركزت العديد من الباحثين في عمليات الهجرة والغزو فهم أفضل لكيفية نشر الخلايا السرطانية على أمل أن تؤدي هذه المعرفة إلى استراتيجيات جديدة للعلاج. من الأهمية بمكان أن هذه الدراسات تتم باستخدام فحوصات موثوقة واستنساخه.
تحليل في المختبر لحركية الخلية يمكن أن يكون تحديا. وضعت منذ سنوات عديدة، يعتبر فحص الدائرة Boyden لتكون معياراً لغزو – الهجرة التحليل7. ومع ذلك، فإنه مضيعة للوقت وغير دقيقة في كثير من الأحيان. اختبار ثاني هو التئام المقايسة8، الذي ينطوي على صنع الصفر على ثقافة أحادي الطبقة خلية، والتقاط الصور لغزو الخلية والهجرة في فترات زمنية محددة. وقد انتقد هذا الأسلوب على نطاق واسع بسبب الاختلافات الكبيرة بين نتائج الاختبارات المتتالية اثنين. ومع ذلك، تطبيق التكنولوجيات الحديثة، ولا سيما في الفحص المجهري، تحسنت إمكانية تكرار نتائج لفحص الجرح الصفر. ويمكن بسهولة إدخال في حاضنات مجاهر الفيديو ويمكن توليد الصور في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية. تسجيل بيانات المجهري هذه الأجهزة وتقديم التحليل التلقائي لالتقاء الخلية الجرح على مر الزمن. الهدف من هذه الورقة هو وصف المقايسة الدائرة Boyden والمقايسة الجرح الصفر الأمثل، ومناقشة مزايا ونقاط الضعف في كل نهج.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تقرير هنا هما طرائق مختلفة لدراسة عملية الغزو والهجرة الخلية. تحليل هذه العملية مهم لفهم العوامل التي تنطوي عليها في تكرار المنتشر، الذي قد يفسر بزيادة حركية من يتدنى الخلايا السرطانية يسمى سرطان الخلايا الجذعية البالغة10،11.
تجربة الدائ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ووضعت هذه التقنيات بالدعم من “يعبي لابيكس” (ANR-11-لابكس-0063)، خطة الافتتاح-إيتا-منطقة (كبير) في إطار علمي ايتوال (كبير 2009-2013)، وغنائي الإنكا المنح-دجوس-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
