듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

Summary

현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.

Abstract

지하실 막 강성, 구성, 건축, 그리고 다공성과 다양 한 세포질 bilayers의 중요 한 구성 요소입니다. 상피 내 피 bilayers의 학문 생체 외에서 전통적으로 bilayer 문화를 활성화 하는 침투성 지원 모델에 의존 해야 하지만 투과 지원 인간의 지하실 막의 다양성을 복제 하는 기능에 제한 됩니다. 반면, 화학 합성을 해야 하는 하이드로 겔 모델 높은 가락 고 소재 강성 및 biomimetic 펩 티 드 또는 단백질의 결합을 통해 생 화 확 적인 구성의 수정에 대 한 허용 한다. 그러나, 그들은 모 셀 연락처 및 마이그레이션 연구 기능 생체 외에서 부족 하기 때문에 전통적인 히드로 모델 기능에 제한 됩니다. 또한, 전통적인 hydrogels 두께 때문 hydrogels의 전체 두께 걸쳐 있는 숨 구멍의 설립이 되었습니다 도전. 현재 연구 사용 하 여 poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels와 소설 아연 산화물 템플릿 메서드 biomimetic hydrogels의 이전 단점을 해결 하기 위해. 그 결과, 선물이 ultrathin, 지하실 멤브레인 같은 히드로 가변 기 공 구조, 기계적 특성, 및 생 화 확 적인 구성 사용자 정의 발판에 confluent 셀룰러 bilayers의 문화입니다.

Introduction

세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질 건설 기계 셀 첨부 파일을 지 원하는 다른 세포 유형 사이 방 벽으로 봉사 하 고 복잡 한 조직 및 장기의 필수 구성 요소를 확인 합니다. 간 질 성 결합 조직, 달리 지하실 멤브레인 (BM) 다른 조직 구획 분할 하는 장벽 역할 ECM의 특수 유형입니다. BMs 약 100 µ m 두께, 그리고 따라서 양쪽에 셀 사이의 직접 및 간접 통신에 대 한 허용. BMs의 두 가지 일반적인 예 혈관 BMs, pericytes 및 내 피 세포 사이의 microvascular 벽에서 발견 되며 내 피 및 상피 세포 사이 발견 되는 기도 BMs. BMs는 건강과 질병, 세포 극성 및 마이그레이션 등 세포 기능 조절에 중요 한 역할을 제공 합니다. ¹ 구성, 강성, 건축, 및 BMs의 다공성 고유한 생리 기능을 촉진 하기 위하여 기관 시스템 간에 다릅니다. 예를 들어 BM 모 셀 통신, 수용 성 분자 확산, 유지 하 고 감염 시 염증 또는 박테리아 면역 세포의 마이그레이션에 대 한 중요 하다. 항공에 모 공 0.75에서 3.86 µ m.² 까지 직경 BM의 전체 두께 걸쳐

BM의 얇은 자연 세포 유형 물리적으로 서로에서 분리 되어, 비록 세포 통신 신호 paracrine 및 연락처 중재를 통해 유지 되는 보장 합니다. 따라서, 생체 외에서, 인간 질병 연구에 연구원 문화 셀룰러 bilayers에 다공성 침투성 지원 삽입에 의존 했습니다. ³ 이러한 모델 건강과 질병에 있는 역할 셀룰러 통신을 이해 하기 위한 중요 한 되었습니다. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} 침투성 지원 삽입 어떻게 백혈구 신규 모집 및 세균 침투; 등의 생리 적 프로세스 조절-셀 신호를 이해 하기 위한 기본 요건을 충족 그러나, 삽입 중요 한 제한이 고 인간 BM. Permeable 지원 모방 하지 삽입 기계 및 생 화 확 적인 tunability 부족과 단순한 다공성 구조를 불규칙 한 숨 구멍을 만드는 섬유 구조를 모방 하지 않습니다 BMs의 전형. 따라서, 세포 프로세스를 영향을 미치는 기본 BM 속성을 다시 만들 수 있는 가변 시스템에 대 한 필요성이 있다.

폴리머 기반 기판 biomimetic 셀룰러 bilayers 맥락을 더 밀접 하 게 비보에 환경에서 공부 하는 BMs의 개발을 위한 이상적인 후보자 이다. ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} 중합체는 기계적으로 가변 및 화학적 통합 biomimetic 펩 티 드 파편. 을 수정할 수 있습니다. ^{11 , 12 , 13} bioinert 폴리머 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) biomimetic BMs를 만드는 데 사용할 수 있습니다 및 최근 작품 자세한 기계적으로 가변 못 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 젤 세포 성장을 지 원하는 다공성 네트워크와의 합성 그리고 염증 성 세포 chemotaxis입니다. ¹⁴ 못 기반 출판 침투성 지원 보다는 인간의 ECM의 보다 현실적인 모델을 제공 하는 기판, 이러한 모델의 대부분은 매우 셀 셀 bilayer 문화를 만들 수 있는 능력을 제한 하는 대략 775 µ m의 깊이와 두께 연락처입니다. ¹⁴

여기, 우리는 못 폴리머 기반 BM 모방 많은 현재 셀 bilayer 문화 기술의 한계를 극복 하는의 창조에 대 한 프로토콜을 제시. 고분자 합성 및 가교은 이후에 선택적으로에서 제거 하는 동안에 산화 아연, 미정 질 생산의 제조에 광범위 하 게 사용 된 자료를 통합 하는 템플릿 방법 개발 했습니다는 결과 대량 중합체입니다. 이 프로세스는 인간의 BMs의 꼬불꼬불한 고 상호 공 네트워크를 흉내 낸 임의의 다공성 네트워크를 생성 합니다. 또한,는 다공성 바늘 생산 동안 반응 산출할의 수정을 통해 산화 아연 microcrystals의 형태와 크기를 변경 하 여 변경할 수 있습니다. 여기에 개발 된 기술은 인간 BM.을 마지막으로, 역학, 다공성, 두께 모방한 ultrathin 히드로 만들고 이러한 BM 비슷한 구조의 생 화 확 적인 구성 쉽게 대부분은 microenvironment를 생성 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 비슷한 그 본 vivo에서.

Protocol

재료 안전 데이터 시트 (MSDS)는 이전 하는 모든 자료의 읽어 보시기 바랍니다 사용 하 고 모든 안전 예방 조치를 사용 하 여 시간. 1입니다. 산화 아연 바늘의 합성 0.04 M Zn (3)2의 250 mL 준비 * 물 250 mL에 아연 질 산의 2.9749 g을 추가 하 여 6 H2O 솔루션. 150ml의 물에 NaOH의 6 g을 추가 하 여 1 M NaOH의 150 mL를 준비 합니다. 핫 플레이트 활동…

Representative Results

못 RGD hydrogels 사이 2 개의 희생 아연 산화물 층 사이 폴리머 솔루션 및 산화 아연 바늘 기 공 템플릿 만들기 형성 되었다. 희생 아연 산화물 구성 요소는 염 산, 지속적인 모 (그림 1)와 ultrathin 못 hydrogels 생성 다음 제거 되었습니다. 산화 아연 바늘의 형태는 전자 현미경 (SEM), 검색 하 여 확인 되었다 고 평균 길이 너비 각각 3.92 ± 0.089 µ m 및 0.43 ± 0.02 µ…

Discussion

여기서 설명 하는 프로토콜을 가변 PEG 하이드로 겔 biomimetic BM 비 계 역할을 만들 수 있다. 특히, 다양 한 PEG 분자 무게 펩 티 드 활용 전략, 그리고 산화 아연 미정 질 구조 또는 농도, 탄성 계수, 생 화 확 적인 속성과 hydrogels의 다공성 구조 수정할 수 있습니다, 각각. Ultrathin 못 비 계는 높은 기 공 밀도 더 많은 기능을 vivo에서 지 세포 막 투과성 지원 모델 (표 2)에 비해 발견의 모?…

Materials

1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A