デュアルのバイオミメティック基底膜として極薄 Porated 弾性ゲルの細胞培養
Summary
現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート メソッドを使用してこのプロトコル記述する可変剛性、気孔率、体内によく似た成分と、極薄のバイオミメティック基底膜の開発細胞外マトリックス。
Abstract
基底膜は、剛性、組成、アーキテクチャ、および気孔率で変わることができる細胞膜の重要なコンポーネントです。内皮細胞上皮膜のin vitro研究伝統的二層文化を有効にすると透過性のサポート モデルに依存しているが、透過性のサポート、人間の基底膜の多様性を複製する能力に制限が。対照的に、化学合成を必要とするハイドロゲル モデル高調整可能、素材の剛性とバイオミメティック ペプチッドまたは蛋白質の定款による生化学的組成の両方の変更を可能にします。ただし、従来のハイドロゲル モデルは、細胞間の接触と移民研究機能の in vitroの毛穴がないため機能に制限されます。さらに、伝統的なゲルの厚さによるハイドロゲルの全体の厚さにまたがる毛穴定款は挑戦されています。本研究で我々 は生体模倣ヒドロゲルの以前の欠点に対処するのに poly-(ethylene-glycol) (PEG) ゲルおよび亜鉛酸化物テンプレート メソッドを使用します。その結果、可変間隙のアーキテクチャ、機械的性質、成分とカスタマイズ可能な足場にコンフルエントの細胞膜の文化を可能にする極薄、基底膜のようなハイドロゲルを提案します。
Introduction
細胞外マトリックス (ECM) は細胞接着をサポートし種類の異なる細胞の間の障壁として機能および複雑な組織や臓器の重要なコンポーネントは、タンパク質の足場を作る。間質結合織と対照をなして基底膜 (BM) は互いから組織のコンパートメントに分割するバリアとして機能する ECM の特殊な型です。BMs は約 100 μ m、厚さ、従ってどちらかの側の細胞間の直接的および間接的な通信を可能にします。BMs の 2 つの一般的な例は、ペリサイトおよび内皮細胞間の血管壁は、血管の BMs と内皮細胞および上皮細胞の間にある気道 BMs です。BMs は役立つ細胞極性や移行などの細胞機能の調節に、健康および病気の重要な役割です。1構成、剛性、アーキテクチャ、および BMs の気孔率は、異なる生理機能を容易にする器官システムによって異なります。たとえば、BM 毛穴は感染時に炎症や細菌中の免疫細胞の移動、細胞間コミュニケーション、可溶性分子拡散を維持するために重要です。気道で毛穴は直径 0.75 から 3.86 μ m2に至るまでの BM の完全な厚さにまたがる
BM の薄い性質が細胞の種類は、1 つの別から物理的に分離、パラクリンと連絡先を介したシグナルを介した細胞間コミュニケーションが維持されることを保証します。したがって、人間の病気のin vitro での研究に研究者は培養細胞膜に多孔質の透水性サポート挿入に頼ってきました。3これらのモデルは、重要な健康および病気の役割を果たしている細胞のコミュニケーションを理解するためにされています。3,4,5,6,7透水性サポート挿入白血球動員や細菌浸潤; などの生理学的プロセスを調節する細胞シグナリング方法を理解するための基本的な要件を満たすただし、挿入の重要な制限があります、人間点換気サポートを模倣する失敗挿入機械的および生化学的な可変性がないし、単純な多孔質構造が不規則な毛穴を作成する線維状構造を模倣していませんBMs の典型的です。したがって、細胞プロセスに影響を与える固有の BM プロパティを再作成することができます可変システムの成長の必要性があります。
ポリマー ベースの基板は、バイオミメティック体内環境をもっと密接に模倣するコンテキストで細胞膜を研究する BMs の開発のための理想的な候補です。8,9,10,11,12ポリマーが機械的に可変、バイオミメティック ペプチド断片.を組み込むこと化学的に変更することができます。11,12,13不活性ポリマー, ポリエチレング リコール (PEG) バイオミメティック BMs を作成する使用することができます、最近の作品の詳細な細胞の成長をサポートする多孔質ネットワークと機械的に可変のペグ アルギニン-グリシン-アスパラギン酸 (RGD) ゲルの合成・炎症細胞走化性。14公開ペグ ベースが基板は、透過性のサポートする範囲よりヒトの ECM のより現実的なモデルを提供、これらのモデルの多くは細胞膜の文化を作成する能力を制限する約 775 μ m の深さを持つ、非常に厚い、連絡先。14
現在の細胞膜培養技術の制約の多くを克服するペグのポリマー ベース BM 模倣を作成するためのプロトコルを紹介します。ポリマーの合成と架橋は、その後、選択的にから削除中に酸化亜鉛微結晶生産の製造に広く使用された材料を組み込んだテンプレート メソッドを開発している、結果として得られるバルク高分子。このプロセスは、人間の BMs の蛇行と相互接続の細孔ネットワークを模倣したランダム多孔性ネットワークを生成します。さらに、気孔率はサイズと針生産時に反応の化学量論の変更を介して酸化亜鉛微結晶の形状を変更することによって変更できます。ここで開発した技術は人間の点最後に、力学、気孔率、厚さを模した超薄ハイドロゲルを作成し、これらの BM のような構造の生化学的組成はほとんどは微小環境を生成する簡単に変更できます。その見られる生体内に似ています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで詳細なプロトコルをバイオミメティック BM 足場として機能する可変ペグ ハイドロゲルを作成できました。具体的には、さまざまな PEG 分子量、ペプチドの活用戦略と酸化亜鉛微結晶構造や濃度、弾性率、生化学的性質と、ヒドロゲルの細孔構造変更できます、それぞれ。極薄のペグ足場は高い気孔密度と基底膜標準透過性のサポート モデル (表 2) と比較して体内で…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らの思慮深い会話と材料科学の専門知識の教授ポール ・ ヴァン ・ タッセルと教授 Chinedum ・ オスジを感謝したいです。この仕事のための資金は、ライアンキャラハン新しいイニシアティブ賞、国立機関の健康 NIBIB BRPR01 EB16629 01A1 によって提供されました。
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
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