Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire

Summary

Les modèles actuels de culture bicouche ne permettent pas des études fonctionnelles in vitro qui imitent en vivo microenvironnements. À l’aide de polyéthylène glycol et une méthode de création de modèles d’oxyde de zinc, ce protocole décrit le développement d’une membrane de sous-sol biomimétique ultra-mince avec rigidité ajustable, la porosité et la composition biochimique qui imite étroitement en vivo matrices extracellulaires.

Abstract

La membrane basale est un élément essentiel des bicouches cellulaires qui peut varier dans la rigidité, la composition, architecture et porosité. Études in vitro des bicouches endothéliales épithéliaux comptent traditionnellement sur des modèles de soutien perméables qui permettent la culture de bicouche, mais les supports perméables sont limités dans leur capacité à reproduire la diversité des humains des membranes basales. En revanche, hydrogel modèles nécessitant une synthèse chimique sont hautement accordables et permettent des modifications de la rigidité du matériau et la composition biochimique par incorporation de protéines ou de peptides biomimétiques. Cependant, les modèles traditionnels d’hydrogel sont limitées à fonctionnalité parce qu’ils manquent de pores pour contacts cellule-cellule et fonctionnelle in vitro les études de la migration. En outre, en raison de l’épaisseur des hydrogels traditionnelles, incorporation des pores qui s’étendent sur toute l’épaisseur des hydrogels a été difficile. Dans la présente étude, nous utilisons des hydrogels poly-(ethylene-glycol) (PEG) et une méthode de création de modèles de roman d’oxyde de zinc à combler les lacunes antérieures des hydrogels biomimétique. Par conséquent, nous présentons un hydrogel ultramince, membrane basale-like qui permet la culture de bicouches cellulaires confluentes sur un échafaud personnalisable avec pore variable architectures, propriétés mécaniques et composition biochimique.

Introduction

Les matrices extracellulaires (ECM) composent les échafaudages de protéine qui soutiennent la fixation des cellules et servent de barrières entre les types cellulaires distincts et constituent une composante essentielle du complexes tissus et organes. Contrairement au tissu conjonctif interstitiel, la membrane basale (BM) est un type spécialisé de ECM qui agit comme une barrière pour diviser les compartiments tissulaires de l’un de l’autre. BMs environ 100 µm d’épaisseur et donc permettant une communication directe et indirecte entre les cellules de chaque côté. Deux exemples courants de BMs sont vasculaires BMs, trouvées dans la paroi microvasculaire entre les péricytes et les cellules endothéliales et BMs des voies aériennes qui sont trouvent entre les cellules endothéliales et épithéliales. BMs jouent un rôle important dans la régulation de la fonction des cellules, telles que la polarité cellulaire et migration, sain ou malade. ¹ la composition, rigidité, architecture et porosité du BMs varie de systèmes d’organes pour faciliter les fonctions physiologiques distinctes. Par exemple, BM pores sont essentiels pour le maintien de la cellule-cellule communication, diffusion de la molécule soluble et pour la migration des cellules immunitaires au cours de l’inflammation ou des bactéries lors de l’infection. Dans les voies respiratoires, pores couvrent la pleine épaisseur de la BM, d’un diamètre allant de 0,75 à 3,86 µm.²

La nature mince de la BM assure que même si les types de cellules sont physiquement séparés l’un de l’autre, la communication intercellulaire via paracrine et contact-signalisation médiée par est préservée. Ainsi, pour étudier les maladies humaines in vitro, les chercheurs comptent sur insertions de support perméable poreux à doubles couches cellulaires de la culture. ³ ces modèles ont été essentiels pour la compréhension de la communication cellulaire qui joue un rôle dans la santé et la maladie. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} support perméable insertions satisfont les exigences de base pour comprendre comment cellule-cellule signalisation régule les processus physiologiques, tels que le recrutement des leucocytes et infiltration bactérienne ; Toutefois, les foyers ont des limitations importantes et ne parviennent pas à imiter un soutien humain de BM. perméable insertions manquent d’accordabilité mécanique et biochimique et la structure poreuse simpliste n’imite pas la structure fibreuse qui crée les pores irréguliers typique de BMs. Par conséquent, il y a un besoin croissant pour les systèmes accordables peut recréer les propriétés natives de BM qui influent sur les processus cellulaires.

Substrats à base de polymères sont des candidats idéaux pour le développement de la biomimétique BMs pour étudier des bicouches cellulaires dans un contexte qui imite mieux l’environnement in vivo . ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} polymères sont mécaniquement accordables et peuvent être chimiquement modifiés afin d’incorporer des fragments de peptide biomimétique. ^{11 , 12 , 13} le bioinert polymère polyéthylène glycol (PEG) peut être utilisé pour construire biomimétique BMs et travaux récents a détaillé la synthèse des gels d’arginine-glycine-aspartique (RGD) PEG mécaniquement accordables avec réseaux poreux qui soutiennent la croissance des cellules et chimiotactisme des cellules inflammatoires. ¹⁴ bien que publié axée sur le PEG substrats a fourni un modèle plus réaliste d’un ECM humaine que supports perméables, beaucoup de ces modèles sont très épais, avec une profondeur d’environ 775 µm qui limite la possibilité de créer des cultures bicouche avec cellule-cellule contacts. ¹⁴

Nous présentons ici un protocole pour la création d’un imitateur BM-à base de polymère PEG qui dépasse de beaucoup les limites des technologies actuelles de la culture du bicouche cellulaire. Nous avons développé une méthode de création de modèles qui incorpore d’oxyde de zinc, un matériau utilisé pour la fabrication de production microcristalline, le polymère au cours de la synthèse et la réticulation, qui est par la suite et sélectivement supprimée de la polymère résultant de vrac. Ce processus génère un réseau poreux aléatoire, imitant le réseau de pores interconnectés et tortueux de BMs humaines. En outre, la porosité peut être modifiée en changeant la taille et la forme de l’oxyde de zinc de microcristaux par une modification de la stoechiométrie de la réaction au cours de la production de l’aiguille. La technique développée ici crée un hydrogel ultra-mince qui imite l’épaisseur humaine BM. Enfin, la mécanique, la porosité et la composition biochimique de ces constructions comme BM peut facilement être modifiée pour générer un micro-environnement qui est la plus semblable à celui vu en vivo.

Protocol

S’il vous plaît lire matériel fiche signalétique (FS) de tous les documents préalables pour utiliser utiliser les mesures de sécurité à tous les temps. 1. synthèse des aiguilles de l’oxyde de Zinc Préparer 250 mL de Zn (NO3) 0,04 M2* solution2O 6 H en ajoutant 2,9749 g de nitrate de zinc à 250 mL d’eau. Préparer 150 mL de 1 NaOH M en ajoutant 6 g de NaOH à 150 mL d’eau. Mettre en place un bain d’huile minér…

Representative Results

PEG-RGD hydrogels ont été formés en intercalant la solution de polymère entre deux couches d’oxyde de zinc sacrificiel et création de modèles de pore avec des aiguilles de l’oxyde de zinc. Oxyde de zinc sacrificiel composants ont ensuite été déposées par l’acide chlorhydrique, générant ultraminces PEG hydrogels avec pores continues (Figure 1). La morphologie des aiguilles de l’oxyde de zinc a été confirmée par microscopie électronique …

Discussion

Le protocole détaillé ici nous a permis de créer un hydrogel PEG accordable pour servir un échafaudage biomimétique BM. Plus précisément, de différents poids moléculaires de PEG, stratégies de peptide de conjugaison et oxyde de zinc structures microcristallines ou concentrations, le module d’élasticité, propriétés biochimiques et une structure poreuse des hydrogels peuvent être modifiés, respectivement. L’échafaudage de PEG ultramince dispose d’une plus grande densité de pores et un plus petit dia…

Materials

1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A