Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

Summary

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Abstract

A membrana basal é um componente crítico do bilayers celulares que pode variar em porosidade, composição, arquitetura e rigidez. Estudos in vitro de epitélio endotelial-bilayers têm tradicionalmente invocado suporte permeável modelos que permitem a cultura da bicamada, mas suporta permeável é limitadas em sua capacidade de replicar a diversidade das membranas de porão humanas. Em contraste, modelos de hidrogel que requerem síntese química são altamente sintonizáveis e permitam modificações de rigidez do material e a composição bioquímica através de incorporação de péptidos biomimetic ou proteínas. No entanto, modelos de hidrogel tradicional são limitados na funcionalidade, porque lhes falta poros para contatos de celular e funcional em vitro estudos de migração. Além disso, devido a espessura de hidrogel tradicional, incorporação de poros que se estendem por toda espessura do hidrogel tem sido um desafio. No presente estudo, nós usamos hidrogel de poly-(ethylene-glycol) (PEG) e um método de modelagem de romance de óxido de zinco para abordar as deficiências anteriores de hidrogel biomimético. Como resultado, nós apresentamos um hidrogel ultrafino, membrana basal-like que permite a cultura de bilayers celulares confluentes em um andaime personalizável com arquiteturas de poro variável, propriedades mecânicas e composição bioquímica.

Introduction

Matrizes extracelulares (ECM) compõem os andaimes de proteína que suportam ligação de célula e servem como barreiras entre tipos de células distintas e são uma componente essencial do complexos tecidos e órgãos. Em contraste com o tecido conjuntivo intersticial, a membrana basal (BM) é um tipo especializado de ECM que age como uma barreira para dividir compartimentos de tecido de um outro. BMs são aproximadamente 100 µm de espessura e, portanto, permitam a comunicação direta e indireta entre as células em ambos os lados. Dois exemplos comuns de BMs são vasculares BMs, encontradas na parede microvascular entre pericitos e células endoteliais e BMs das vias aéreas que são encontradas entre as células endoteliais e epiteliais. BMs servem um papel importante na regulação da função celular, tais como polaridade celular e migração, na saúde e na doença. ¹ a composição, rigidez, arquitetura e porosidade da BMs varia entre os sistemas do órgão para facilitar as funções fisiológicas distintas. Por exemplo, BM poros são essenciais para manter a comunicação célula-célula, difusão da molécula solúvel e para a migração de células do sistema imunológico durante inflamação ou bactérias durante a infecção. Nas vias aéreas, poros abrangem a totalidade da espessura da BM, com diâmetros variando de 0,75 a 3,86 µm.²

A natureza fina da BM assegura que apesar de tipos de células são fisicamente separados um do outro, comunicação intercelular via parácrina e contato-mediada por sinalização é preservada. Assim, para estudar doenças humanas in vitro, os pesquisadores têm contado com inserções de suporte poroso permeável para bilayers celular de cultura. ³ esses modelos têm sido fundamentais para a compreensão da comunicação celular que desempenha um papel na saúde e na doença. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} suporte permeável inserções satisfazem os requisitos básicos para a compreensão de como sinalização celular regula processos fisiológicos, tais como o recrutamento de leucócitos e infiltração bacteriana; no entanto, as inserções têm limitações significativas e não conseguem imitar um apoio humano de BM. permeável inserções faltam pré-definido mecânico e bioquímico, e a estrutura porosa simplista não imitam a estrutura fibrosa que cria os poros irregulares típico da BMs. Portanto, há uma necessidade crescente de sistemas ajustáveis que pode recriar as BM as propriedades nativas que influenciam os processos celulares.

Baseado em polímero substratos são candidatos ideais para o desenvolvimento de biomimetic BMs para estudar bilayers celulares em um contexto que imita mais de perto o ambiente na vivo . ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} polímeros são mecanicamente ajustáveis e podem ser quimicamente modificados para incorporar fragmentos de peptídeo biomimético. ^{11 , 12 , 13} o bioinert polímero polietileno glicol (PEG) pode ser usado para construir biomimetic BMs e recente trabalho detalhou a síntese de géis de arginina-glicina-aspartato (RGD) PEG mecanicamente ajustáveis com redes porosas que suportam o crescimento celular e quimiotaxia de células inflamatórias. ¹⁴ embora publicado baseado em PEG substratos forneceu um modelo mais realista de um humano ECM que suporta permeável, muitos desses modelos são extremamente grossos, com uma profundidade de aproximadamente 775 µm que limita a capacidade de criar culturas BICAMADA com celular contatos. ¹⁴

Aqui, apresentamos um protocolo para a criação de um mímico BM baseado em polímero PEG que supera muitas das limitações das atuais tecnologias de cultura celular BICAMADA. Nós desenvolvemos um método de modelagem que incorpora o polímero durante a síntese e reticulação, que é posteriormente e seletivamente removida do óxido de zinco, um material amplamente usado para o fabrico de produção microcristalina, o polímero de massa resultante. Este processo gera uma aleatória rede porosa, imitando a rede de poros interconectados e tortuoso da BMs humanas. Além disso, a porosidade pode ser alterada, alterando o tamanho e a forma dos microcristais de óxido de zinco através de modificação da estequiometria da reação durante a produção de agulha. A técnica desenvolvida aqui cria um hidrogel ultrafino que imita a espessura do BM. humano por último, a mecânica, a porosidade e a composição bioquímica dessas construções BM-como facilmente pode ser alterada para gerar um microambiente que é mais semelhante ao que vimos na vivo.

Protocol

Leia Material segurança folha de dados (MSDS) de todos os materiais anteriores usar e usar as precauções de segurança em todos os tempos. 1. síntese de agulhas de óxido de zinco Preparar 250 mL de um 0,04 M Zn (NO3)2* solução de 6 H2O, adicionando 2,9749 g de nitrato de zinco para 250 mL de água. Prepare 150 mL de 1 M de NaOH adicionando 6 g de NaOH para 150 mL de água. Configurar um banho de óleo mineral em um prato q…

Representative Results

PEG-RGD hidrogel formaram-se pela imprensa a solução de polímero entre duas camadas de óxido de zinco sacrificial e criação de modelos de poros com agulhas de óxido de zinco. Óxido de zinco sacrificial componentes foram removidos então com ácido clorídrico, gerando ultrafinos PEG hidrogel com poros contínuos (Figura 1). A morfologia das agulhas de óxido de zinco foi confirmada pela microscopia eletrônica (SEM), e o comprimento médio e largura e…

Discussion

O protocolo detalhado aqui nos permitiu criar um hidrogel PEG ajustável para servir como um andaime biomimetic BM. Especificamente, por diferentes pesos moleculares de PEG, estratégias de conjugação de peptídeo e estruturas microcristalina de óxido de zinco ou concentrações, o módulo de elasticidade, propriedades bioquímicas e estrutura porosa do hidrogel podem ser modificado, respectivamente. O andaime PEG ultrafino apresenta uma maior densidade de poros e menor diâmetro dos poros seja mais mimético das cara…

Materials

1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A