Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula
Summary
Modelos de cultura bicapa actuales no permiten estudios funcionales en vitro que imitan en vivo microambientes. Uso de glicol de polietileno y un método de plantillas de óxido de zinc, este protocolo describe el desarrollo de una membrana del sótano biomiméticos ultrafino con rigidez sintonizable, porosidad y composición bioquímica que imita muy de cerca en vivo matrices extracelulares.
Abstract
La membrana basal es un componente crítico de bicapas celulares que puede variar en rigidez, composición, arquitectura y porosidad. Estudios in vitro de bicapas endotelial epitelial han dependido tradicionalmente de modelos de apoyo permeables que permitan la cultura de la bicapa, pero soportes permeables son limitados en su capacidad para replicar la diversidad de humanos las membranas del sótano. En cambio, modelos de hidrogel que requieren síntesis química son altamente armoniosas y permitan la modificación de la rigidez del material y la composición bioquímica mediante la incorporación de proteínas o péptidos biomiméticos. Sin embargo, modelos de hidrogel tradicional están limitados funcionalidad porque carecen de poros para contactos célula-célula y funcional en vitro estudios de migración. Además, debido al grueso de los hidrogeles tradicionales, ha sido difícil incorporación de los poros que abarcan todo el espesor de los hidrogeles. En el presente estudio, utilizamos hidrogeles poly-(ethylene-glycol) (PEG) y un método de plantillas nuevo óxido de zinc para abordar las deficiencias anteriores de hidrogeles biomiméticos. Como resultado, presentamos un hidrogel ultrafino, similar a la membrana basal que permite la cultura de bicapas celulares confluentes en un andamio personalizable con arquitecturas de poro variable, propiedades mecánicas y composición bioquímica.
Introduction
Matrices extracelulares (ECM) son los andamios de la proteína que soporte accesorio de la célula y sirven como barreras entre tipos celulares distintos y son un componente esencial de los órganos y tejidos complejos. En contraste con el tejido conectivo intersticial, la membrana basal (BM) es un tipo especializado de ECM que actúa como una barrera para dividir compartimentos de tejido uno del otro. BMs son aproximadamente 100 μm de espesor y por lo tanto permiten la comunicación directa e indirecta entre las células a cada lado. Dos ejemplos comunes de BMs son vasculares BMs, encontradas en la pared microvascular entre los pericitos y las células endoteliales y BMs en las vías respiratorias que se encuentran entre las células endoteliales y epiteliales. BMs sirven un papel importante en la regulación de la función de la célula, tales como migración y polaridad celular, en salud y enfermedad. 1 la composición, rigidez, arquitectura y porosidad de BMs varía según los sistemas del órgano para facilitar distintas funciones fisiológicas. Por ejemplo, los poros BM son críticos para mantener la comunicación célula-célula, difusión de la molécula soluble y para la migración de células inmunes durante la inflamación o las bacterias durante una infección. En las vías respiratorias, poros abarcan todo el espesor del BM, con diámetros que van desde 0.75 3.86 μm.2
La naturaleza fina de la BM asegura que aunque los tipos de la célula están separados físicamente uno del otro, comunicación intercelular a través de señalización paracrina y contacto mediado se conserva. Por lo tanto, para estudiar enfermedades humanas in vitro, los investigadores han confiado en insertos de apoyo permeable poroso a bicapas celulares cultura. 3 estos modelos han sido críticos para la comprensión de la comunicación celular que desempeña un papel en la salud y la enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 apoyo permeable insertos satisfacen los requisitos básicos para la comprensión de cómo la señalización de la célula regula procesos fisiológicos, tales como reclutamiento de leucocitos e infiltración bacteriana; sin embargo, los insertos tienen limitaciones importantes y dejar de imitar a un humano soporte BM Permeable insertos carecen de afinabilidad mecánico y bioquímico, y la estructura porosa simplista no imitan la estructura fibrosa que crea los poros irregulares típico de BMs. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de sistemas ajustables que pueden recrear las propiedades nativas de BM que influyen en los procesos celulares.
Sustratos a base de polímero son candidatos ideales para el desarrollo de biomimetic BMs para estudiar celulares bicapas en un contexto que imita más de cerca el ambiente en vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polímeros son mecánicamente ajustables y pueden ser modificados químicamente para incorporar fragmentos de péptido biomimético. 11 , 12 , 13 el bioinert polímero polietileno glicol (PEG) se puede utilizar para construir biomiméticos BMs y el trabajo reciente ha detallado la síntesis de geles de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) PEG mecánicamente ajustables con redes porosas que apoyen el crecimiento de la célula y Quimiotaxis de células inflamatorias. 14 aunque publicado basada en PEG sustratos proporcionan un modelo más realista de un ECM humano que soportes permeables, muchos de estos modelos son extremadamente gruesos, con una profundidad de aproximadamente 775 μm que limita la capacidad de crear culturas bicapa con célula contactos. 14
Aquí, presentamos un protocolo para la creación de un imitador de BM clavija del polímero que supera muchas de las limitaciones de las tecnologías actuales de la cultura de la bicapa del celular. Hemos desarrollado un método de las plantillas que incorpora el óxido de zinc, un material ampliamente utilizado para la fabricación de producción microcristalina, en el polímero durante la síntesis y el entrecruzamiento, que se retira posteriormente y de forma selectiva de la polímero resultante en a granel. Este proceso genera una red porosa al azar, mímico la red de poros interconectados y tortuoso de BMs humanas. Además, la porosidad puede modificarse cambiando el tamaño y la forma de los microcristales de óxido de zinc a través de la modificación de la estequiometría de la reacción durante la producción de aguja. La técnica desarrollada aquí crea un hidrogel ultrafino que imita el grueso del BM humanos por último, la mecánica, la porosidad, y la composición bioquímica de estas construcciones BM-como se puede modificar fácilmente para generar un microambiente que es la más similar a ése visto en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo detallado aquí nos ha permitido crear un armonioso hidrogel de PEG para servir como un andamio biomiméticos BM. En concreto, de diferentes pesos moleculares de PEG, péptido verbal estrategias y estructuras microcristalinas de óxido de zinc o concentraciones, el módulo de elasticidad, propiedades bioquímicas y la estructura porosa de los hidrogeles pueden ser modificados, respectivamente. El andamio de PEG ultrafino cuenta con una mayor densidad de poro y un menor diámetro de poro más mimético de las…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Prof. Paul Van Tassel y Prof. Chinedum Osuji sus conversaciones reflexivas y conocimientos de la ciencia de los materiales. Fondos para este trabajo fue proporcionada por el nuevo premio de iniciativa Dubinsky e institutos nacionales de salud NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
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