Ultratunna rated elastisk Hydrogels som en biomimetiska basalmembranet för dubbla cellodling

Summary

Nuvarande lipidens kultur modeller tillåter inte för funktionellt in vitro- studier som efterliknar i vivo mikromiljö. Använda polyetylenglykol och en zinkoxid mallhantering metod, beskriver det här protokollet utvecklingen av en ultrathin biomimetiska basalmembranet med avstämbara stelhet, porositet och biokemiska sammansättning som noggrant efterliknar i vivo extracellulära matriser.

Abstract

Basalmembranet är en kritisk komponent i cellernas lipidmonolager som kan variera i stelhet, sammansättning, arkitekturen och porositet. In vitro studier av endothelial-epitelial lipidmonolager traditionellt har förlitat sig på genomsläppliga stöd modeller som möjliggör lipidens kultur, men genomsläpplig stöder begränsas i sin möjlighet att replikera mångfalden av mänskliga källaren membran. Däremot hydrogel modeller som kräver kemisk syntes är mycket avstämbara och möjliggör ändringar av både den materiella stelhet och biokemiska sammansättning via inkorporering biomimetiska peptider eller proteiner. Traditionella hydrogel-modeller är dock begränsade funktionalitet eftersom de saknar porer för cell cell kontakter och funktionellt in vitro- migration studier. Dessutom på grund av tjockleken på traditionella hydrogels varit införlivandet av porer som spänner över hela tjockleken på hydrogels utmanande. I den aktuella studien använder vi poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels och en roman zinkoxid mallhantering metod för att åtgärda tidigare bristerna i biomimetiska hydrogels. Därför presenterar vi ett supertunt, basalmembranet-liknande hydrogel som tillåter kulturen av konfluenta cellulär lipidmonolager på en anpassningsbar byggnadsställning med variabel pore arkitekturer, mekaniska egenskaper och biokemiska sammansättning.

Introduction

Extracellulära matriser (ECM) utgör de protein-ställningar som stöder cell fastsättning och tjäna som barriärer mellan olika celltyper och är en viktig komponent i komplexa vävnader och organ. I motsats till interstitiell bindväv är basalmembranet (BM) en specialiserad typ av ECM som fungerar som en barriär att dela upp vävnad fack från varandra. BMs är ungefär 100 µm tjockt, och därför tillåta för direkt och indirekt kommunikation mellan celler på vardera sidan. Två vanliga exempel på BMs är vaskulär BMs, Funna i mikrovaskulära väggen mellan pericyter och endotelceller, och luftvägarna BMs som finns mellan endotelceller och epiteliala celler. BMs tjäna en viktig roll i regleringen av cellernas funktion, som cell polaritet och migration, hälsa och sjukdom. ¹ den sammansättning, stelhet, arkitekturen och porositet av BMs varierar mellan organsystem att underlätta olika fysiologiska funktioner. Till exempel är BM porer kritiska för att upprätthålla cell-cell kommunikation, lösliga molekyl diffusion, och för migrering av immunceller under inflammation eller bakterier vid infektion. I luftvägarna spänner porer BM, full tjocklek med diametrar alltifrån 0,75 till 3.86 µm.²

Tunn beskaffenhet BM säkerställer att även om celltyper är fysiskt åtskilda från varandra, kommunikationen via parakrin – och kontakt-medierad signalering bevaras. Således, för att studera mänskliga sjukdomar in vitro forskare har förlitat sig på porösa genomsläpplig stöd skär till kultur cellulär lipidmonolager. ³ dessa modeller har varit avgörande för att förstå den cellular kommunikation som spelar en roll vid hälsa och sjukdom. ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} genomsläpplig stöd skär uppfyller de grundläggande kraven för att förstå hur cell-cell signalering reglerar fysiologiska processer, såsom leukocyt rekrytering och bakteriell infiltration; dock skären har betydande begränsningar och misslyckas att efterlikna en mänsklig BM. Permeable stöd skär saknar både mekanisk och biokemiska tunability, och den förenklade porösa strukturen inte efterlikna den fibrösa struktur som skapar oregelbundna porerna typiskt för BMs. Därför finns det ett växande behov av avstämbara system som kan återskapa de infödda BM-egenskaper som påverkar cellulära processer.

Polymer-baserade substrat är perfekta kandidater för utveckling av biomimetiska BMs att studera cellulära lipidmonolager i ett sammanhang som närmare efterliknar miljön i vivo . ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12} polymerer är mekaniskt avstämbara och kan vara kemiskt modifierade för att införliva biomimetiska peptidfragment. ^{11 , 12 , 13} de bioinert polymer polyetylenglykol (PEG) kan användas för att konstruera biomimetiska BMs och senaste arbete har detaljerade syntesen av mekaniskt avstämbara PEG arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) geler med porösa nätverk som stöder celltillväxt och inflammatoriska celler Kemotaxis. ¹⁴ även om publicerade PEG-baserade substrat som tillhandahålls en mer realistisk modell av en mänsklig ECM än genomsläpplig stöder, många av dessa modeller är extremt tjocka, med ett djup av ungefär 775 µm som begränsar möjligheten att skapa lipidens kulturer med cell-cell kontakter. ¹⁴

Här presenterar vi ett protokoll för skapandet av en PEG polymerbaserade BM härma som övervinner många av begränsningarna i nuvarande cell lipidens kultur teknik. Vi har utvecklat en templating metod som innehåller zinkoxid, ett flitigt använt material för tillverkning av mikrokristallin produktion, i polymeren under syntes och crosslinking, som därefter och selektivt tas bort från den resulterande bulk polymer. Den här processen genererar ett slumpmässigt porösa nätverk, härma det slingriga och sammankopplade pore nätverket av mänskliga BMs. Ytterligare, porositeten kan ändras genom att ändra storleken och formen av den zinkoxid microcrystals via ändring av den reaktion stökiometri under nålen produktionen. Den teknik som utvecklats här skapar en ultrathin hydrogel som härmar tjockleken på mänskliga BM. Slutligen, mekanik, porositeten och biokemiska sammansättningen av dessa BM-liknande konstruktioner kan enkelt ändras för att generera en närmiljön som är mest liknar att ses i vivo.

Protocol

Läs materialet varuinformationsblad (MSDS) av allt material som tidigare gånger att använda och använda säkerhetsföreskrifter på alla. 1. Sammanfattning av zinkoxid nålar Bereda 250 mL en 0,04 M Zn (nr3)2* 6 H2O lösning genom att tillsätta 2.9749 g zink nitrat till 250 mL vatten. Förbereda 150 mL 1 M NaOH genom att lägga till 6 g NaOH till 150 mL vatten. Ställa in badkar mineralolja på en värmeplatta med omrörare …

Representative Results

PEG-RGD hydrogels bildades genom sandwiching polymer lösningen mellan två uppoffrande zinkoxid och skapa pore mallar med zinkoxid nålar. Uppoffrande zinkoxid komponenter togs sedan bort med saltsyra, generera ultrathin PEG hydrogels med kontinuerlig porer (figur 1). Morfologi av zinkoxid nålar bekräftades av svepelektronmikroskopi (SEM), och genomsnittlig längd och bredd var fast beslutna att vara 3.92 ± 0.089 µm och 0,43 ± 0,02 µm, respektive (<str…

Discussion

Protokollet beskrivs här har tillåtit oss att skapa en avstämbara PEG hydrogel att fungera som en biomimetiska BM byggnadsställning. Specifikt, av varierande PEG molekylvikter, peptid konjugation strategier, och zinkoxid mikrokristallin strukturer eller koncentrationer, elasticitetsmodulen, kan biokemiska egenskaper och porös struktur av hydrogels ändras, respektive. Ultratunna PEG ställningen har högre pore densitet och en mindre pordiameter som är mer mimetiska av de funktioner som finns i i vivo käl…

Materials

1M Hydrogel Chloride (HCl)	EMD	HX0603-75 2.5L	Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves.
1X PBS	Gibco	14040-133 500 mL	None
Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O)	Sigma-Aldrich	228737-500g	Use with eye protection and gloves.
Sodium Hydroxide (NaOH)	Macron Chemicals	278408-500g	Use with eye protection and gloves.
Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O)	Fisher Scientific	AC45180010 1 kg	Use with eye protection and gloves.
Methanol (CH3OH)	J.T. Baker	9070-05 4L	Use in fume hood with eye protection and gloves.
VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS	VWR	97068-085	Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS
Mineral oil	CVS	PLD-B280B	None
Round bottom flask	ChemGlass		N/A
Thermometer			N/A
Stir bar			N/A
Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick	Thermo Scientific	420-004T	Spray with ethanol and let dry prior to use.
Glass pasteur pipets			N/A
1 mL rubber bulbs			N/A
Plastic 100 mm petri dishes			N/A
Sterile forceps			N/A
Silicone isolators			0.8 mm thick
Polydimethylsiloxane (PDMS) punches			N/A
Glass bottles			N/A
6 well plates	Cellstar	657 160	N/A
Filter Paper	Whatman	8519	N/A
Stirrer-hot plate	VWR Dya-Dual	12620-970	Use with eye protection and gloves.
2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5	Sigma-Aldrich	24650-42-8	Use with eye protection and gloves.
1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO)	Aldrich		Use with eye protection and gloves.
Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH)	Fluka	81280-1kg	Use with eye protection and gloves.
RGDS	Life Tein	180190	Use with eye protection and gloves.
Blak-Ray long wave UV lamp	UVP	Model B 100AP	N/A
Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	N/A