Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom
Summary
Wij rapporteren een kleine haarspeld RNA (shRNA) en de volgende generatie sequencing-gebaseerd protocol voor het identificeren van de regelgevers van de inactivering van het x-chromosoom in een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten aan de methyl CpG bindende eiwit 2) MeCP2) gen op het X-chromosoom inactief.
Abstract
Voorwaartse genetische schermen met behulp van verslaggever genen ingevoegd in de heterochromatin zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen voor controle van de epigenetische in modelorganismen onderzoeken. Technologieën met inbegrip van korte haarspeld RNAs (shRNAs) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) hebt ingeschakeld op dergelijke schermen in diploïde cellen van zoogdieren. Hier beschrijven we een grootschalige shRNA scherm voor regelgevers van x-chromosoom inactivering (XCI), met behulp van een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen klopte in het C-terminus van de methyl CpG bindend-proteïne 2 (MeCP2) gen op het inactieve x-chromosoom (Xi). Reactivering van de constructie in de verslaggever cellijn verleende overleving voordeel onder hygromycin B selectie, waarmee we een grote shRNA bibliotheek scherm en identificeren van haarspelden dat gereactiveerd de verslaggever door te meten met behulp van hun na selectie verrijking volgende-generatie sequencing. De verrijkte haarspelden werden vervolgens individueel gevalideerd door het testen van hun vermogen om het activeren van de luciferase verslaggever op Xi.
Introduction
Één de meest voorkomende vormen van erfelijke geestelijke stoornis bij vrouwtjes, Rett syndroom, wordt veroorzaakt door heterozygoot mutaties in MeCP2, een x-chromosoom-gen dat codeert voor een eiwit dat essentieel is voor de normale functie van de neuronale1. Een mogelijke aanpak voor de behandeling van deze aandoening zou reactivering van het wild-type MeCP2 -allel op de Xi, zoals herstel van MeCP2 expressie bleek te keren neurologische tekorten in een muismodel van deze ziekte1, 2 , 4. echter strak epigenetische monddood maken van één van de twee X chromosomen in vrouwelijke cellen wordt gehandhaafd gedurende de levensduur van een organisme3,4, en robuuste reactivering van een Xi-gen zou waarschijnlijk vereisen een grote verstoring in meerdere epigenetische regelgevende trajecten.
Om te identificeren factoren nodig zijn voor onderhoud MeCP2 monddood maken, ontwikkelden we eerst een transgeen muismodel uitvoering een MeCP2– luciferase – hygromycin weerstand gene fusion (MeCP2-LUC-HR) op één van de twee X chromosomen (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Hoewel het MeCP2 uitgedrukt uit de fusion-constructie bleek instabiel en resulteerde in een verlies van functie, fenotypische nabootsen MeCP2 schrapping in hemizygous mannen (XMeCP2-LUC-HR/Y), de uitdrukking van de genen van de verslaggever was in een patroon overeen met de uitdrukking van endogene MeCP25gemakkelijk worden opgespoord. Wij vervolgens gegenereerd vereeuwigd fibroblast klonen met de constructie op actieve of inactieve x-chromosoom, en bevestigd dat voormalig uitgedrukt wild type MeCP2 en niet de verslaggever constructie; de inverse Gold voor de laatstgenoemde. Wanneer blootgesteld aan een DNA demethylating agent bekend te trekken gene silencing, 5-azacytidine (5-AZA), de cellen met de verslaggever op de Xi (“verslaggever cellen”) activiteit in een bioluminescentie assay, die aangeeft dat onze constructie kan worden gereactiveerd opgedaan en daarom gebruikt voor genetische screening.
Volgende ontwikkelden we een scherm high-throughput genetische voor regelgevers MeCP2 monddood maken. De verslaggever-cellijn werd eerst besmet met een retrovirale bibliotheek met > 60.000 verschillende shRNAs targeting > 25.000 genen in de muis genoom5,6, en vervolgens onderworpen aan hygromycin B selectie. Haarspeld frequentie bedroeg vergeleken in pre en post selectie monsters met behulp van de volgende generatie sequencing, als verslaggever reactivering verleende groei voordeel onder hygromycin B-selectie en resulteerde in de verrijking van verantwoordelijk haarspelden. Met behulp van deze aanpak, we geïdentificeerd 30 genen betrokken bij MeCP2 monddood maken, en vervolgens de bevindingen bevestigd door transducing de verslaggever cellen met individuele haarspelden en het meten van hun luciferase activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
In onze recente studie6, we genereerden een lymfkliertest cellijn met luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten tot MeCP2 op de Xi, en het transduced met een bibliotheek van > 60.000 shRNAs targeting > 25.000 genen. We vonden 30 genen waarvan knock-down toegekende overleving voordeel onder hygromycin B selectie suggereren hun rol in de controle van het MeCP2 en het x-chromosoom zwijgen. Deze resultaten werden gevalideerd door het transducing van de gerapporteerde cellij…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Ross Dickins van de Universiteit van Melbourne genadig voorzien van de bibliotheek van de shRNA gebruikt in het scherm. Dit werk werd gefinancierd door de Rett syndroom onderzoek vertrouwen (A.B.).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
