במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל
Summary
אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.
Abstract
קדימה מסכי גנטי באמצעות גנים כתב מוכנס לתוך הטרוכרומטין שימשו בהרחבה לחקור מנגנוני השליטה epigenetic דגם אורגניזמים. טכנולוגיות כולל סיכת ראש קצר RNAs (shRNAs) ו באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) אפשרו כגון מסכי בתאים בתרבית של דיפלואידי. כאן נתאר על הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש (XCI), מסך shRNA בקנה מידה גדול באמצעות קו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז והפיל גנים עמידות hygromycin ב- C-הסופית של איזה CpG מחייב חלבון ג’ין (MeCP2) 2 על שמושרש לא פעיל (Xi). שהפעלה של הבונה בקו תא כתב הענקת יתרון הישרדות תחת בחירת hygromycin B, ומאפשרת לנו מסך ספרייה גדולה shRNA ולזהות סיכות זה מחדש הכתב על ידי מדידת שלהם באמצעות פוסט-בחירה העשרה הדור הבא רצפי. סיכות מועשר היו תוקף אז בנפרד על-ידי בדיקת היכולת להפעיל את הכתב לוציפראז ב- Xi.
Introduction
אחת הצורות הנפוצות ביותר של לקות נפשית תורשתי אצל נקבות, תסמונת רט, נגרמת על ידי משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מוטציות ב- MeCP2, ג’ין שמושרש מקודד חלבון חיוני עבור תפקוד נורמלי1. גישה אפשרית לטיפול בהפרעה זו יהיה שהפעלה של אלל MeCP2 פראי-סוג ב ה-Xi, כמו שיקום של הביטוי MeCP2 הוצגה להיפוך גרעונות עצביים במודל של עכברים של מחלה זו1, 2 , 4. עם זאת, epigenetic להחרשת לאחד שני כרומוזומי בתאים הנשי X נשמר הדוק לאורך כל מחזור של3,אורגניזם4ותדרוש חזקים שהפעלה של ג’ין קי סביר רב סרן הפרעה במשעולים רגולטוריות epigenetic מרובים.
כדי לזהות גורמים הדרושים לתחזוקה של שתיקת MeCP2 , אנחנו קודם פיתח מודל העכבר הטרנסגניים נושא שילוב גנים עמידות hygromycin (MeCP2-לוק-HR) MeCP2– לוציפראז – לאחד שני כרומוזומי X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. למרות MeCP2 הביע של הבונה פיוז’ן הוכיחה להיות לא יציב ולא הביא לאובדן של פונקציה, phenotypically היה שווה מחיקה MeCP2 אצל זכרים hemizygous (X /YMeCP2-לוק-HR), הביטוי של הגנים כתב היה בקלות לזיהוי בתבנית עקבית עם הביטוי של MeCP2 אנדוגני5. אנחנו מכן שנוצר פיברובלסט מונצחים שיבוטים עם הבונה על שמושרש פעילה או לא פעילה, ואישר שלשעבר את ביטוי wild type MeCP2, לא כתב הבונה; ההופכי היה נכון עבור האחרון. כאשר נחשף של הדנ א. demethylating סוכן ידוע מחסלים. ג’ין להחרשת, 5-azacytidine (5-עזה), תאים עם הכתב על Xi (“תאים כתב”) צבר פעילות assay ביולומינסנציה, המציין כי לבנות שלנו יכול להפעיל מחדש ולכן משמש עבור בדיקה גנטית.
פיתחנו הבא תפוקה גבוהה גנטי על מסך הרגולטורים של שתיקת MeCP2 . הקו תא כתב קודם היה נגוע המכיל ספריית retroviral > מיקוד shRNAs שונים 60,000 > 25,000 הגנים לאורך כל העכבר הגנום5,6, ונחשפו ואז לבחירה hygromycin B. סיכת ראש תדירות נמשל ב מראש, דוגמאות פוסט-בחירה באמצעות רצף הדור הבא, כמו כתב הפעלה מחדש הענקת יתרון צמיחה תחת hygromycin B בחירת וכתוצאה העשרה של סיכות אחראי. באמצעות גישה זו, זיהתה 30 גנים מעורבים MeCP2 להשתיק, ואנו לאחר מכן אישר את הממצאים על-ידי transducing התאים כתב עם סיכות בודדות ומדידת פעילותם לוציפראז.
Protocol
Representative Results
Discussion
האחרונים שלנו ללמוד6, יצרנו קו תא מאתר עם לוציפראז, גנים עמידות hygromycin דבוקה MeCP2 ב- Xi ולאחר transduced זה עם ספרייה של > מיקוד shRNAs 60,000 > 25,000 הגנים. מצאנו 30 גנים אשר יתרון הישרדות שהוענקו דפיקה למטה תחת בחירת hygromycin B, רומז תפקידם בשליטה של MeCP2 והשתקה שמושרש. תוצאות אלו היו אומת על-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים רוס Dickins של אוניברסיטת מלבורן למתן באדיבות הספרייה shRNA בשימוש על המסך. עבודה זו מומן על ידי רט תסמונת מחקר לבטוח (הארית).
Materials
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2′-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
