Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Summary

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Abstract

Menselijke norovirus lijders aanzienlijke volksgezondheid en economische verliezen wereldwijd. Opkomende in vitro teelt voorschotten gelden niet nog voor routinematige opsporing van het virus. De huidige detectie en kwantificering technieken, die voornamelijk afhankelijk zijn van nucleïnezuur amplificatie, discrimineren niet besmettelijke uit niet-besmettelijke virale deeltjes. Het doel van dit artikel is om specifieke details over recente vorderingen in de technieken samen worden gebruikt om te verwerven verdere informatie over de status van de infectiviteit van virale deeltjes. Een techniek omvat de beoordeling van de binding van een norovirus ssDNA aptamer te capsids. Aptamers hebben het voordeel dat het gemakkelijk wordt gesynthetiseerd en gewijzigd, en zijn goedkoop en stabiel. Een andere techniek, dynamisch licht verstrooiing (DLS), heeft het voordeel van Eiwitmantel gedrag optreedt in oplossing. Elektronenmicroscopie zorgt voor visualisatie van de structurele integriteit van de virale capsids. Hoewel veelbelovend, zijn er enkele nadelen aan elke techniek, zoals niet-specifieke aptamer binding aan positief geladen moleculen van monster matrices, eis van gezuiverde Eiwitmantel distributielijsten en arme gevoeligheid voor elektronenmicroscopie. Niettemin, als deze technieken worden gebruikt in combinatie, het lichaam van de geproduceerde gegevens vindt u uitgebreidere informatie over norovirus Eiwitmantel integriteit die kan worden gebruikt voor het afleiden van de infectiviteit, informatie die essentieel is voor een nauwkeurige evaluatie van inactivatie methoden of interpretatie van virusdetectie. Dit artikel bevat de protocollen voor het gebruik van deze methoden te discrimineren besmettelijke menselijke norovirus deeltjes.

Introduction

Menselijke norovirus is verantwoordelijk voor een aanzienlijke volksgezondheid last wereldwijd, waardoor ongeveer 685 miljoen ziekten en 212,000 doden jaarlijks¹, aan een kostprijs in de miljarden dollars^2,3. Vandaag, omvat norovirus detectie en kwantificering genoom versterking en/of ligand-gebaseerde platforms. Eerstgenoemde is over het algemeen de voorkeur, want het is gevoeliger, kwantitatieve informatie, en over het algemeen lagere risico van valse positieve resultaten^{4 heeft}. De meest voorkomende norovirus detectie en kwantificering genoom amplificatie techniek is reverse-transcriptase kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Omdat het richt zich op en een klein segment van het menselijke norovirus genoom versterkt, RT-qPCR alleen is niet in staat zijn van discriminatie tussen besmettelijke en niet-infectieuze deeltjes, als vrije genomic RNA, beschadigde capsids met genoom, en capsids met dodelijk gemuteerd/afgekapt genoom kunnen nog worden versterkt door RT-qPCR. Terwijl twee nieuwe in vitro teelttechnieken voor menselijke norovirus^5,6 hebben onlangs gemeld, beide nog steeds vertrouwen op RT-qPCR voor virus kwantificering en zijn nog niet haalbaar methoden voor routinematige klinische/milieu testen voor menselijke norovirussen. RT-qPCR blijft dus, de gouden standaard voor het testen van de klinische/milieu.

Andere methoden in vitro zijn ontwikkeld in een poging om de status van de infectiviteit van norovirus deeltjes beter te schatten. Deze methoden kunnen in het algemeen worden gecategoriseerd als die waarmee de integriteit van het norovirus Eiwitmantel en die evaluatie genoom integriteit. De voormalige aanpak is meer populair. Een veelgebruikte methode is RNase Voorbehandeling voorafgaand aan de winning van virale genomic RNA, maar dit houdt geen rekening met virale deeltjes, die intact blijven, maar niet over de mogelijkheid om te binden host receptoren/co-factoren, evenals virale deeltjes die hebben dodelijk gemuteerd of zijn afgekapt of beschadigd marginaal genoom⁷. Eiwitmantel integriteit kan ook worden geëvalueerd op basis van het vermogen van het virus te binden aan menselijke norovirus co-receptor/co-factoren, die koolhydraten histo-bloed groep antigenen (HBGAs) genoemd. HBGAs in de intestinale epitheliale cellen van de gastheer aanwezig zijn als onderdeel van glycoproteïnen of glycolipiden (onder meerdere andere weefsels) en in lichaamsvloeistoffen zoals speeksel uitgescheiden kan worden. Darmen bacteriën die HBGA-achtige stoffen bevatten op hun oppervlakken hebben ook aangetoond dat het menselijke norovirus^8,9,10te binden, en dergelijke interactie kunnen bevorderen norovirus infectie⁵. Het basisconcept van het gebruik van HBGA-bindende is dat alleen virale deeltjes kunnen binden met de vermeende receptor/co-factor zou kunnen cellen te infecteren. Meerdere studies suggereren dat kraal gebaseerde HBGA bindende voorafgaand aan versterking van de nucleïnezuur een veelbelovende methode voor infectiviteit discriminatie^{11,12,13,14is, 15,16}. Een grote uitdaging met betrekking tot de HBGAs is dat geen enkel HBGA type alle menselijke norovirus genotypen kunt binden. Om aan te pakken dit, is varkens maag mucin, waarin HBGAs, gebruikt in plaats van gezuiverde HBGA koolhydraten in het belang van gemak van synthese, consistentie, en lagere kosten.

Een recente publicatie door Moore et al. ¹⁷ introduceerde een reeks nieuwe technieken voor het schatten van menselijke norovirus Eiwitmantel integriteit. In plaats van HBGAs, Moore et al. ¹⁷ binding van een grotendeels reactief nucleïnezuur aptamer (M6-2)¹⁸ en in het algemeen reactief monoklonaal antilichaam (NS14)¹⁹ tot en met warmtebehandelde GII.4 Sydney norovirus capsids (virusachtige deeltjes of experimentele) onderzocht en vergeleken dit om de binding aan synthetische HBGAs. Nucleic zuur-aptamers zijn korte (~ 20-80 nt) één gestrande nucleïnezuren (ssDNA of RNA) die Vouw in unieke driedimensionale structuren als gevolg van hun volgorde en binden van een doel. Omdat ze nucleïnezuren, zijn ze minder duur; gemakkelijk chemisch gesynthetiseerde, gezuiverd en gemodificeerde; en stabiele te verwarmen. Verscheidene verslagen van aptamers gegenereerd tegen norovirussen bestaat, met een aantal van hen tonen brede reactiviteit aan een verscheidenheid van stammen^18,20,21,22. Bij wijze van voorbeeld, Moore et al. ¹⁷ aangetoond dat aptamer M6-2 gebonden aan gezuiverde, geassembleerd menselijke norovirus capsids (experimentele) en gedragen op dezelfde manier aan HBGA in de afhankelijkheid van de virale Eiwitmantel om hogere orde (bijv, secundaire en tertiaire) structuur voor eiwit binding aan het optreden. Aan de andere kant, een aanzienlijk deel van norovirus VLP binding aan antilichaam NS14 bleef na capsids werden volledig gedenatureerd. Evaluatie van norovirus bindend in de studie van Moore et al. ¹⁷ werd gedaan met behulp van een eenvoudige, plaat gebaseerde methode ELISA, vergelijkbaar met de uitzondering dat aptamers worden gebruikt in plaats van antilichamen (vandaar de methode werd genoemd ELASA). Deze hoge doorvoer experimentele methode werd gebruikt om de effecten van verschillende behandelingen op de norovirus Eiwitmantel, werk dat is waardevol voor het begrijpen van het mechanisme van virale inactivatie bij blootstelling aan fysische of chemische stressoren evalueren. Een nadeel van deze methode is echter de lagere gevoeligheid en gebrek aan tolerantie voor matrix-geassocieerde verontreinigingen op hogere niveaus waardoor niet-specifieke binding door de aptamers.

Moore et al. ¹⁷ gebruikt een andere methode, dynamisch licht verstrooiing (DLS), voor controle van aggregatie van virale deeltjes naar aanleiding van warmtebehandeling. DLS wordt gebruikt bij het evalueren van de grootte van nanoparticle schorsingen en heeft uitgebreid naar eiwitten^23,24 en virussen^25,26,27. De intensiteit van de lichtverstrooiing door deeltjes in oplossing fluctueert als een functie van deeltjesgrootte, zodat voor de berekening van diffusie coëfficiënt en vervolgens deeltje diameter gevestigde formules gebruiken. De DLS-techniek kunt onderscheiden van de hydrodynamische diameter van verspreide deeltjes naar de nanoschaal, die maakt de ontdekking van verspreide virussen, individuele Eiwitmantel eiwitten of Dimeren en virus aggregaten op basis van grootte²⁷. Virus aggregatie, vertegenwoordigd door een toename van de grootte van de deeltjes, is kenmerkend voor verlies van Eiwitmantel integriteit. Aangezien de Eiwitmantel is gedenatureerd en haar structuur verstoord, hydrofobe residuen worden blootgesteld en veroorzaken de deeltjes te plakken aan elkaar en vormen van aggregaten. Distributielijsten kunnen worden gebruikt voor het meten van deeltjesgrootte na een opgegeven behandeling of de kinetiek van aggregatie in real-time^17,28. Deze methode heeft het voordeel van het toestaan van waarneming van Eiwitmantel gedrag in oplossing maar vereist hoge concentraties van gezuiverde Eiwitmantel, die wellicht niet geheel representatief is voor het virus in zijn natuurlijke staat.

De laatste methode gebruikt door Moore et al. ¹⁷ was transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Hoewel deze methode gevoeligheid mist en geen kwantitatieve gegevens produceert, staat het voor de visualisatie van de effecten van verschillende behandelingen op de virale Eiwitmantel structuur. Hoewel nog niet ideaal voor klinische/omgevingsinstellingen, is het gebruik van deze methoden in combinatie waardevol inzicht in menselijke norovirus inactivatie. Het doel van dit artikel is bedoeld als diepgaande protocollen voor de plaat gebaseerde bindende assay (ELASA), Distributielijsten, en TEM voorbereiding methoden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van warmtebehandelingen die men op het norovirus Eiwitmantel in het kader van de behandelingen effecten op Eiwitmantel integriteit zoals gepresenteerd in Moore et al. ¹⁷.

Protocol

1. bindende Assay voor het evalueren van verlies van hogere Norovirus Eiwitmantel orderstructuur plaat gebaseerde Opmerking: een zeer vergelijkbaar ELASA protocol bij degene die hier gepresenteerd is gepubliceerd 29, en soortgelijke ELASA testen zijn eerder gemeld als onderdeel van onderzoek elders 17 , 18 , 22 artikelen. Warmtebehandeling van menselijke…

Representative Results

De structurele integriteit van menselijke norovirus GII.4 Sydney capsids (experimentele) werd beoordeeld met behulp van verschillende nieuwe methoden, zoals gepresenteerd door Moore et al. 17. ten eerste, een experiment werd gedaan die de integriteit van de capsids als een functie van hun vermogen om te binden een vermeende receptor/co-factor (HBGA) of ssDNA aptamer (M6-2) werden vergeleken (Figuur 1). De getoonde resultaten z…

Discussion

Het protocol en de hier beschreven technieken bieden een middel om de beoordeling menselijke norovirus Eiwitmantel integriteit/functionaliteit. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de effecten van inactivatie behandelingen tegen het virus, en potentieel meer traditionele inactivatie evaluatiemethoden zoals RT-qPCR of plaque bepaling kunnen aanvullen. Bijvoorbeeld, biedt de evaluatie van chemische of fysische inactivatie door plaque assay alleen een zekere mate van virus i…

Materials

Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate	Fisher (Costar)	07-200-36
Lid for 96-well plate	Thermo Fisher	3098
Paraffin film (Parafilm)	Thermo Fisher	PM999
1x PBS (pH 7.2)	Life Technologies	20012-050
Polysorbate 20	Sigma-Aldrich	P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20	N/A	N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids	N/A	N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes	Genesee Scientific	22-154G
2 thermocyclers	Bio-Rad	1861096
Tabletop mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Skim milk solids	Thermo Fisher	LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated	Glycotech	01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’	Integrated DNA Technologies	N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004	Life Technologies	SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature	Thermo Fisher	50-76-00
1 M phosphoric acid	N/A	N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm	Tecan	Infinite m200 Pro
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program	N/A	N/A
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument	Malvern Instruments	N/A
Vortex	Fisher Scientifc	02-215-365
Quartz cuvette	Hellma	104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use)	Malvern Instruments	ZEN0040
Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film	Ladd Research	10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers	Ted Pella	5372-NM
Qualitative filter paper	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glass petri dishes	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2)	N/A	N/A
2% uranyl acetate	N/A	N/A