Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности
Summary
Обычные методы использование вирусного генома амплификации ограничены, их неспособность различать инфекционных от неинфекционных частиц. Цель этой статьи — предоставить подробные протоколы для альтернативных методов для оказания помощи в дискриминации инфекционных норовирус частиц с помощью привязки aptamer, Динамическое рассеяние света и просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Человека норовирус виктимизацией значительного общественного здравоохранения и экономических потерь во всем мире. Возникающие в vitro успехи выращивания еще не применимы для рутинной обнаружения вируса. Текущий обнаружения и количественного определения методов, которые полагаются главным образом на амплификации нуклеиновых кислот, не допускали дискриминации инфекционных от неинфекционных вирусных частиц. Цель этой статьи – представить конкретные сведения о последних достижениях в методы, используемые вместе, для того чтобы получить также информацию о статусе инфективности вирусных частиц. Один метод предполагает оценки привязки норовирус ssDNA aptamer к capsids. Аптамеры имеют преимущество быть легко синтезируется и изменения и недорогой и стабильной. Другой метод, динамического рассеяния света (DLS), имеет преимущество наблюдения за поведением капсида в растворе. Электронная микроскопия позволяет для визуализации структурной целостности вирусных capsids. Хотя перспективные, есть некоторые недостатки каждого метода, например неспецифические aptamer привязку положительно заряженные молекулы из Образец матрицы, требование очищенный капсид для DLS и плохой чувствительностью для электронной микроскопии. Тем не менее когда эти методы используются в сочетании, тело получаемых данных обеспечивает более полную информацию о целостности норовирус капсида, который может использоваться для выведения инфективности, информация, которая имеет важное значение для точной оценки методы инактивации или интерпретации обнаружения вирусов. Эта статья обеспечивает протоколы для использования этих методов дискриминации инфекционных человека норовирус частиц.
Introduction
Человека норовирус отвечает за бремя значительного общественного здравоохранения во всем мире, вызывая около 685 миллионов заболеваний и 212 000 смертей ежегодно1, стоимостью в миллиарды долларов2,3. Сегодня норовирус обнаружения и количественного определения включает амплификацию генома и/или лиганд-платформ. Первый обычно предпочтительным, как он является более чувствительным, обеспечивает количественную информацию и имеет обычно более низкий риск4ложных положительных результатов. Наиболее распространенными норовирус обнаружения и количественного определения генома усиления техники является обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Потому что она направлена и усиливает небольшой сегмент генома человека норовирус, RT-ПЦР в одиночку не способны проводить дискриминацию между инфекционных и неинфекционных частицы, как свободный геномной РНК, повреждения capsids, содержащие геномов и capsids с смертельно мутировал/усечен геномов могут по-прежнему усиливается RT-ПЦР. Хотя недавно поступили два новых в vitro культивирования методов для человека норовирус5,6 , оба по-прежнему полагаются на RT-ПЦР для количественного определения вирусов и еще не являются возможные методы для рутинных клинических и экологические тестирование для человека норовирусы. Таким образом RT-ПЦР остается золотым стандартом для клинических/окружающей среды тестирования.
В попытке лучше оценить состояние инфективности норовирус частиц были разработаны другие методы в пробирке . Эти методы могут быть вообще отнесены те, которые касаются целостность норовирус капсида и те оценки целостности генома. Первый подход является более популярным. Часто используемым методом является РНКазы предварительной обработки до извлечения вирусного геномной РНК, однако это не учитывает вирусные частицы, которые остаются нетронутыми, но не имеют возможности привязки узла рецепторов/co факторов, а также вирусные частицы, которые мутировали смертельно или обрезать или незначительно повреждены геномов7. Капсид целостность может также оцениваться основано на способности вируса для привязки к человека норовирус co-receptor/co факторов, которые являются углеводы известен как группа крови histo антигены (HBGAs). HBGAs присутствуют в кишечной эпителиальных клеток хозяина в составе гликопротеинов или гликолипидов (среди нескольких других тканях) и может быть сделано секретным в телесных жидкостей, таких как слюна. Также было показано кишечные бактерии, содержащие HBGA-подобных веществ на их поверхности, привязать человека норовирус8,9,10, и такого взаимодействия может способствовать норовирус инфекции5. Основная концепция использования HBGA привязки является, что только вирусные частицы способны привязки предполагаемого рецептор/co-factor будет способен заражать клетки. Множественные исследования показывают, что шарик-привязку на основе HBGA предшествующего амплификация нуклеиновой кислоты является перспективным методом инфективности дискриминации11,12,13,14, 15,16. Одной из основных задач относительно HBGAs является, что без одного HBGA типа можно привязать все человеческие норовирус генотипов. Для решения этой проблемы, свиного желудка муцина, который содержит HBGAs, был использован вместо очищенный HBGA углеводы в интересах простоты синтеза, последовательность и снижение стоимости.
В недавно опубликованном Мур и др. 17 представил набор новых методов для оценки целостности человека норовирус капсида. Вместо HBGAs, Мур и др. 17 расследование привязки широко реактивной нуклеиновой кислоты aptamer (M6-2)18 и19 широко реактивной моноклональных антител (NS14) – термически capsids GII.4 Сидней норовирус (вирус типа частиц или VLP) и сравнил это для привязки к синтетическим HBGAs. Нуклеиновые кислоты аптамеры являются короткие (~ 20-80 nt) одного мель нуклеиновые кислоты (ssDNA или РНК), сложить в уникальных трехмерных структур вследствие их последовательности и связывающие цели. Потому что они нуклеиновых кислот, они являются менее дорогостоящими; легко химически синтезированных, очищенная и изменение; и стабильной для тепла. Существует несколько сообщений о аптамеры генерируется против норовирусов, с некоторыми из них показаны широкий реактивности в различных штаммов18,20,21,22. В качестве примера, Мур и др. 17 показали что aptamer M6-2 привязан к capsids очищенный, собранных человека норовирус (VLP) и аналогичным образом относились к HBGA в зависимость от вирусного капсида поддерживать высшего порядка (например, среднее и высшее) структуры белков для Привязка к произойти. С другой стороны значительная доля норовирус VLP Связывание антитела к NS14 остались после того, как были полностью денатурированный capsids. Оценка норовирус привязки в исследовании Мур и др. 17 было сделано с помощью простой, основанного на пластину метода аналогичны ELISA, за исключением, что вместо антитела используются аптамеры (отсюда был вызван метод ELASA). Этот экспериментальный метод высокой пропускной способности использовался для оценки влияния различных методов лечения на норовирус капсида, работу, которая является ценной для понимания механизма вирусной инактивации после воздействия на физические или химические раздражители. Однако один из недостатков этого метода является нижней чувствительность и отсутствие терпимости для матрицы связанные загрязняющих веществ на более высоких уровнях, которые вызывают неспецифической привязки путем аптамеры.
Мур и др. 17 используется другой метод, динамического рассеяния света (DLS), для мониторинга агрегации вирусных частиц в ответ термической обработки. DLS часто используется для оценки размера наночастиц суспензий и был продлен до23,белки вирусов и24 26,–25,27. Интенсивность света, рассеянного частиц в растворе колеблется в зависимости от размера частиц, позволяя для расчета коэффициента диффузии и затем диаметр частиц, устоявшихся формулам. DLS технику можно отличить гидродинамические диаметр дисперсных частиц вплоть до наноразмерных, который позволяет обнаружения рассредоточенных вирусов, отдельных капсульных белков или димеры и вирус статистическими выражениями, основанными на размер27. Вирус агрегации, представленный увеличение размера частиц, свидетельствует о потери целостности капсида. Как денатурировано капсида и нарушается его структуры, гидрофобные остатки подвергаются и вызывают частицы слипаются и образуют агрегаты. DLS может использоваться для измерения размера частиц после указанного обращения или кинетика агрегации в реальном времени17,28. Этот метод имеет преимущество, позволяя наблюдения поведения капсида в растворе, но требует высокой концентрации очищенный капсида, которые не могут быть полностью представительным вируса в своем естественном состоянии.
Последний метод, используемые Мур и др. 17 был просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Хотя этот метод не хватает чувствительности и не производят количественных данных, он позволяет для визуализации эффектов различных обработок вирусного капсида структуры. Хотя не еще идеально подходит для клинических и экологические параметры, использование этих методов в сочетании ценные в понимании человека норовирус инактивации. Цель этой статьи — предоставить углубленные протоколы для привязки на основе плиты assay (ELASA), DLS, и методы подготовки ТЕА используется для исследовать влияние термообработки на норовирус капсида в контексте лечения последствий капсид целостность, представленные в Moore et al. 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол и описанные здесь методы предоставляют средства оценки человека норовирус капсид целостности/функциональность. Эти методы могут быть использованы для получения механистический понимание последствий инактивации препаратов против вируса и потенциально могут дополнять боле…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана сельского хозяйства и продовольствия исследований инициатива конкурентных Грант № 2011-68003-30395 из Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов, национального института продовольствия и сельского хозяйства в рамках проекта NoroCORE. Финансирование для открытого доступа заряда была предоставлена Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов Америки. Мы хотели бы поблагодарить Роберт Атмар (колледж Бейлор, Хьюстон, Техас) за любезно предоставленную нам очищенный capsids и Валери Lapham за помощь с изображениями ТЕА. Мы также хотели бы поблагодарить Франк н. Барри за помощь нам начать эксперименты представил.
Materials
| Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure | |||
| 96-well, medium-binding polystyrene EIA plate | Fisher (Costar) | 07-200-36 | |
| Lid for 96-well plate | Thermo Fisher | 3098 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Thermo Fisher | PM999 | |
| 1x PBS (pH 7.2) | Life Technologies | 20012-050 | |
| Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 | N/A | N/A | |
| Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids | N/A | N/A | |
| Individual 0.2 ml PCR tubes | Genesee Scientific | 22-154G | |
| 2 thermocyclers | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tabletop mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Skim milk solids | Thermo Fisher | LP0031B | |
| Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated | Glycotech | 01-017 | |
| Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 | Life Technologies | SNN2004 | |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature | Thermo Fisher | 50-76-00 | |
| 1 M phosphoric acid | N/A | N/A | |
| Microplate reader capable of reading 450 nm | Tecan | Infinite m200 Pro | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis of Plate-Based Assay Results | |||
| Microsoft Excel or similar program | N/A | N/A | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynamic Light Scattering Experiments | |||
| Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument | Malvern Instruments | N/A | |
| Vortex | Fisher Scientifc | 02-215-365 | |
| Quartz cuvette | Hellma | 104-002-10-40 | |
| Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) | Malvern Instruments | ZEN0040 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission Electron Microscopy Sample Preparation | |||
| Nickel electron microscopy grids with carbon support film | Ladd Research | 10880-100 | |
| Self-closing reverse electron microscopy tweezers | Ted Pella | 5372-NM | |
| Qualitative filter paper | Sigma-Aldrich (Whatman) | WHA1002055 | |
| Glass petri dishes | Sigma-Aldrich | BR455743 | |
| 100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) | N/A | N/A | |
| 2% uranyl acetate | N/A | N/A |
References
- Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920 (2015).
- Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
- Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
- Law, J. W. -. F., Ab Mutalib, N. -. S., Chan, K. -. G., Lee, L. -. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770 (2015).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell – derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
- Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -. A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124 (2017).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586 (2014).
- Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
- Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
- Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
- Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
- Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
- Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
- Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -. A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
- Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
- Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087 (2013).
- Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
- Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -. A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805 (2014).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not?. Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
- Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
- Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
- Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
- Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
- Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
- Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -. A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
- Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
- Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
- Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
- Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
- Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
- Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).
