Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Summary

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Abstract

DNA-beschadiging is een gemeenschappelijk fenomeen voor elke cel tijdens zijn levensduur, en wordt gedefinieerd als een wijziging van de chemische structuur van genomic DNA. Kankertherapieën, zoals radio- en chemotherapie, introduceren enorme hoeveelheid extra DNA-beschadiging, leidt tot de arrestatie van de celcyclus en apoptosis te beperken van de progressie van kanker. Kwantitatieve beoordeling van DNA-beschadiging tijdens de experimentele kankertherapie is een belangrijke stap ter rechtvaardiging van de effectiviteit van een genotoxische agent. In deze studie, richten we ons op een eencellige elektroforese assay, ook bekend als de komeet assay, die enkele kwantificeren kan en dubbele streng DNA breekt in vitro. De bepaling van de komeet is een DNA schade kwantificering methode die efficiënt en gemakkelijk uit te voeren, en heeft weinig tijd/begroting eisen en hoge reproduceerbaarheid. Hier, wijzen wij op het nut van de komeet assay voor een preklinische studie door de beoordeling van het effect van de genotoxische van olaparib/temozolomide combinatietherapie naar U251 glioma cellen.

Introduction

De komeet assay werd in 1984 voor het eerst ontwikkeld door Ostling en Johanson door aan te tonen dat de migratie van DNA fragmenten van kernen onder een neutrale voorwaarde¹. De techniek werd later ontwikkeld door Singh et al., waaruit blijkt dat een alkalische toestand aanzienlijk verhoogd de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de test². Sindsdien, de neutrale komeet bepaling wordt meestal gebruikt om op te sporen double-stranded DNA breekt, terwijl de alkalische komeet assay gevoeliger voor kleinere hoeveelheden DNA schade is, met inbegrip van enkele en dubbele streng DNA, alkali-labiele sites, DNA-DNA breekt of DNA-eiwit dwarsbinding en DNA single-strand einden gekoppeld aan onvolledige excisie repareren sites^3,4. Beide testen visualisatie van gefragmenteerde DNA, verlenen en een eenvoudige manier om te kwantitatief DNA-schade te evalueren. De komeet bepaling wordt beschouwd als een gevoelige methode voor in vitro en in vivo genetische toxicologische studies en is van toepassing op de verschillende onderzoekgebieden, zoals vroege drug-kandidaat selectie, milieubewaking, menselijke biomonitoring, en fundamenteel onderzoek op DNA-beschadiging en repareren van⁵.

Het principe van de test is dat onder een elektrisch veld, gefragmenteerde DNA migreert uit het nucleoïde lichaam (ook bekend als de “komeet-head”) en vormt een vlek van DNA in de agarose gel (ook bekend als de “komeet-staart”). Met de nucleotide kleuring, kan de omvang van de schade van DNA door het analyseren van “kometen” gevormd door deze eencellige elektroforese worden gekwantificeerd. Berekening van het moment van de staart kan verder helpen aan het vergelijken van DNA-beschadiging onder verschillende experimentele groepen. Vergeleken met traditionele methoden van opsporing van DNA schade, is de bepaling van de komeet directe, gevoelige, goedkope en relatief eenvoudig.

Radiotherapie en chemokuren zijn gemeenschappelijke strategieën voor de behandeling van kanker door het genereren van enkele streng en dubbele streng DNA breekt in chromosomen⁶. De recente vooruitgang in DNA-reparatie-remmers laat een meer effectieve genotoxische werking door combinatie chemotherapie, en daarom, vermindert potentieel systemische bijwerkingen zoals bloedarmoede, infectie en het beenmerg onderdrukken^{7, 8}. in deze studie, toonden we het onderzoek van een poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-remmer, olaparib (Ola)⁹. PARP is een overvloedige nucleaire eiwit en is verantwoordelijk voor DNA base excision repair door de vorming van een poly (ADP-ribose) polymeer¹⁰. Temozolomide (TMZ) is een oraal beschikbaar alkylerend agent en is wijd verbeid gebruikt voor glioma patiënten behandeling. Met behulp van de bepaling van de komeet te kwantificeren van DNA-beschadiging, we laten zien dat de DNA-beschadiging in glioma cellen, hetgeen olaparib/temozolomide combinatietherapie is een effectieve strategie suggereert voor de behandeling van glioma, als combineren olaparib met temozolomide diep verbetert vergeleken met temozolomide alleen¹¹.

Protocol

1. voorbereiden reagentia 1 x PBS 100 mL 10 x PBS met 900 mL dH 2 O Verdun en breng de pH op 7.4 met behulp van een pH-meter. Bewaren bij kamertemperatuur. Lysis oplossing (LS) bereiden 2.5 M NaCl, 100 mM Dinatrium-EDTA, 10 mM Tris base en 200 mM NaOH in 900 mL dH 2 O; het duurt gewoonlijk ongeveer 20 min te laat het mengsel volledig los. Breng de pH op 10 met behulp van een pH-meter. Voeg 1% sodium lauryl dat en 1% Tr…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor de uitvoering van de bepaling van de komeet en data-analyse (Figuur 1). Resultaten van de alkalische en neutrale komeet testen bleek dat de staart van de komeet van Doxorubicine-behandeld U251 cellen (1 µM, 20 h) langer was en had hogere intensiteit van het DNA, suggereren een aanzienlijke accumulatie van gefragmenteerde DNA als gevolg van chemotherapie (Figuur 2). <p cl…

Discussion

De bepaling van de komeet is een doeltreffend instrument voor het meten van enkele en dubbele streng DNA-einden op cellulair niveau. De bepaling is algemeen toegepast als een “gouden standaard” in studies met betrekking tot genotoxiciteit en biomonitoring¹³, variërend van basis laesies, DNA crosslinks Geneesmiddelenontwikkeling en alkali-gevoelige plaatsen. In de huidige studie toonden we twee verschillende stapsgewijze protocollen voor alkalisch en neutraal komeet testen, respectievelijk. Combin…

Materials

Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf