コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価
Summary
コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA 損傷を測定するアルカリ性と中性の彗星の試金を記述します。
Abstract
DNA 損傷は、その寿命の間にセルごとに一般的な現象であるし、ゲノム DNA の化学構造の変化として定義されています。ラジオや化学療法などのがんの治療法は、癌の進行を抑える細胞周期停止やアポトーシスにつながる追加の DNA 損傷の膨大な量を紹介します。実験的ガン治療中に DNA 損傷の定量評価は、遺伝毒性エージェントの有効性を正当化するための重要なステップです。本研究では単一を定量化できますコメット試験として知られている単一細胞電気泳動アッセイに着目し、体外で二重鎖 DNA の区切り。コメット ・ アッセイは、効率的かつ容易に行える、DNA 損傷定量化法、低時間/予算要求、高い再現性。ここでは、我々 は olaparib/テモゾロミド併用療法 U251 神経膠腫細胞の遺伝毒性影響を評価することで臨床研究のコメット ・ アッセイの有用性を強調表示します。
Introduction
最初、1984 年は、中性条件1下核から断片を DNA の移行を示すことによっての Ostling と・ ジョハンソンによって開発コメット ・ アッセイが使用されました。テクニックは、シンら、アルカリ条件は、特異性と再現性アッセイ2に大幅に増加を示すによって後で開発されました。以来、中立コメットアッセイをほとんど使用して対し、アルカリ コメットアッセイは少量のシングルを含む、DNA 損傷に対してより敏感、二重鎖 DNA 切断、アルカリ不安定なサイト DNA DNA 二本鎖 DNA 切断を検出するか、Dna-タンパク質の架橋と不完全切除に関連付けられている DNA 一本鎖切断修復サイト3,4。両方試金断片化された DNA の可視化および DNA 損傷を定量的に評価する簡単な方法を提供できます。コメット ・ アッセイはin vitroとin vivo遺伝毒性学的研究法が機密とみなされ、初期医薬品候補の選択、環境モニタリング、人間バイオモニタ リングなど、様々 な研究分野に適用基礎 DNA 損傷研究し、5を修復します。
アッセイの原理は、電場下で断片化された DNA 核体 (「彗星頭」とも呼ばれる) のうちの移行、agarose のゲル (「彗星テール」とも呼ばれる) の DNA 汚れを形成します。ヌクレオチドは染色、この単一細胞の電気泳動によって形成された「彗星」を分析することによって DNA 損傷の程度を定量化することができます。テール モーメントの計算は、さまざまな実験的グループの間で DNA 損傷を比較するさらに助けることができます。DNA 損傷の検出の伝統的な方法と比較して、コメット ・ アッセイは直接、敏感な安価な比較的単純です。
放射線治療と化学療法は、癌治療のための一般的な戦略一本鎖の生成、二重鎖 DNA 染色体6に改します。DNA 修復阻害剤の最近の進歩の併用療法によりより効果的な遺伝毒性効果としたがって、貧血、感染症、骨髄抑制7,などの全身性の副作用が減る可能性があります。8します。 本研究で示したポリ (adp-リボース) ポリメラーゼ (PARP 阻害剤, olaparib (Ola)9の調査。PARP は豊富な核蛋白質である、10ポリ (adp-リボース) ポリマーを形成することにより DNA 塩基除去修復を担当。テモゾロミド (TMZ) は、経口投与可能なアルキル化剤で神経膠腫患者の治療に広く使用されています。DNA 損傷を定量化するコメット ・ アッセイを用いたテモゾロミドと深く olaparib を組み合わせて olaparib/テモゾロミド併用療法は神経膠腫の治療に効果的な戦略を提案する神経膠腫細胞における DNA 損傷を高めることを紹介します。テモゾロマイドだけで11と比較。
Protocol
Representative Results
Discussion
コメット ・ アッセイは、細胞レベルでの単一および二重鎖 DNA 切断を測定するための効率的なツールです。アッセイは、研究については遺伝毒性とバイオモニタ リング13基本病変、DNA クロスリンク、医薬品開発およびアルカリ敏感なサイトに至る「黄金の標準」として広く適用されています。本研究では、我々 はそれぞれアルカリ性と中性の彗星の試金のための 2 つの異?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH、NCI、CCR の学内研究プログラムによって支えられました。すべての著者は、CCR、NCI、NIH から学内の研究助成金を受け取った。
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?. Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O’Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
