Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo
Summary
Análise quantitativa do conteúdo da célula dentro do nervo ciático murino é difícil devido à escassez do tecido. Este protocolo descreve um método para a digestão do tecido e preparação que fornece células suficientes para análise de citometria de fluxo de populações de células imunes dos nervos de ratos individuais.
Abstract
Nervo-residente células imunes no sistema nervoso periférico (SNP) são essenciais para a manutenção da integridade neuronal em um nervo saudável. As células do sistema imunológico do PNS são afetadas pela lesão e a doença, que afeta a função nervosa e a capacidade de regeneração. Células do sistema imunológico neuronais comumente são analisadas por imunofluorescência (IF). Enquanto se é essencial para determinar a localização das células imunes no nervo, se só é semi quantitativa e o método é limitado ao número de marcadores que podem ser analisados simultaneamente e o grau de expressão de superfície. Neste estudo, citometria de fluxo foi usada para análise quantitativa de infiltração de leucócitos em nervos ciático ou gânglios da raiz dorsal (DRGs) de ratos individuais. Única célula análise foi realizada utilizando DAPI e várias proteínas foram analisadas simultaneamente para a expressão de superfície ou intracelular. Ambos os nervos ciático de um rato que foram tratados de acordo com este protocolo gerado eventos nucleada único de ≥ 30.000. A proporção de leucócitos no nervo ciático, determinado pela expressão de CD45, foi aproximadamente 5% do teor total de célula no nervo ciático e aproximadamente 5-10% em DRG. Embora este protocolo enfoca principalmente a população de células imunes dentro o PNS, a flexibilidade de citometria de fluxo para medir uma série de marcadores simultaneamente significa que as outras populações de células presentes dentro do nervo, como células de Schwann, pericitos , fibroblastos e células endoteliais, podem também ser analisadas usando esse método. Esse método, portanto, fornece um meio novo para estudar os efeitos sistêmicos sobre o PNS, tais como biblioteca e modelos genéticos de neuropatia ou doenças crônicas, como diabetes.
Introduction
Células do sistema imunológico que entra o PNS da circulação, conforme definido pela expressão de CD45 e CD11b, ajudam a manter a integridade do nervo e desempenhar um papel tanto na regeneração e degeneração1. Macrófagos (definidos pela sua expressão de CD68 no mouse) podem ser desviados para um fenótipo inflamatório, expressando mais MHC classe II e CD86 em sua superfície (M1), ou para um fenótipo de anti-inflamatórios, expressando mais CD206 intracelular (M2)2 . Inclinação do fenótipo macrófago é um processo dinâmico, regulado através de Akt sinalização3, refletindo as diferentes tarefas de macrófagos na defesa contra patógenos (M1) e o papel na regeneração de tecidos (M2). Regeneração de um nervo lesionado requer primeiro fagocitose dos restos de mielina por macrófagos no nervo4,5e anti-inflamatório (CD68+CD206+) M2 macrófagos têm sido mostrados para promover a consequência natural do axônio na PNS6. Reduzido de recrutamento ou macrófagos para o PNS, ou capacidade prejudicada para a fagocitose pode resultar em regeneração prejudicada e manutenção da integridade do nervo. Inflamatórios macrófagos M1, expressar o MHC-classe II, são menos capazes de fagocitose de macrófagos M2, e inflamação neuronal está implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas várias7.
As mudanças que ocorrem para o sistema imunológico residente de nervo em consequência de danos podem ser quantitativas, manifestando-se na perda de CD45+ leucócitos (ou aumento da infiltração de CD45+ leucócitos no caso inflamação), ou qualitativa, tais como mudança do fenótipo de macrófagos de M2 para M1 fenótipo. As células do sistema imunológico do PNS tradicionalmente foram analisadas por meio da se, usando seções congeladas ou parafina material8. Se é necessário para determinar a localização das células de interesse. No entanto, quantificação usando se muitas vezes baseia-se em contagem de um número relativamente pequeno de células em uma seção estreita do tecido, tornando a quantificação confiável e vulnerável a viés de seleção. Para identificação dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico, a detecção simultânea de marcadores extracelulares ou intracelulares é necessária, enquanto a determinação do fenótipo macrófago requer pelo menos pelo menos dois marcadores, especificamente CD206 e MHC classe II. Como mais comumente microscópios disponíveis limitam-se a canais de pelo menos duas cores, tais como o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE), a caracterização dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico por IF pode ser restritiva e incompleta, exigindo a necessidade de ter vários slides, derivado da mesma área de interesse, que são coradas e analisadas em paralelo. Este aspecto demorado, portanto, não é necessário se presta à análise de amostra grande moda. Além disso, como a maioria dos marcadores de interesse são extracelulares, a deteção em tecido, que também tem sido incorporado em parafina ou cryoconserved, pode ser problemática devido o rompimento da integridade da membrana e o mascaramento de resumos, bem como a perda de os antígenos do interesse da utilização de solventes, tais como acetona e metanol9.
Em contraste, fluxo cytometry, que mede óptico e características de fluorescência das células únicas em suspensão como passam através de um feixe de luz, fornece um meio mais prático e abrangente para a análise das populações de células. Citometria de fluxo, ao invés de produzir uma imagem digital do tecido, fornece uma quantificação automatizada de parâmetros definidos, que incluem de uma célula tamanho relativo e índice reflexivo, referido como o scatter para frente (FSC), complexidade granularidade/interna ou lado-scatter (SSC) e a intensidade de fluorescência relativo, proporcionando que a célula tem sido rotulada com um fluoróforo adequado, tais como um anticorpo conjugado. Um citômetro de fluxo típico consiste de dois, lasers refrigerado a ar; um laser de argônio produz luz azul em 488 nm e um laser de hélio-neon produz luz em 633 nm. Esta combinação permite a detecção e medição, simultaneamente, pelo menos cinco alvos na superfície ou no interior do compartimento intracelular. Citômetros mais avançados podem consistir de vários lasers, que permitem a detecção de até oito diferentes fluorochromes ao mesmo tempo, proporcionando que o pico de emissão comprimentos de onda de fluorochromes os selecionado não se sobrepõem significativamente.
Para a análise por citometria de fluxo, o tecido de interesse deve primeiro ser enzimaticamente digerido, geralmente com colagenase, para gerar uma suspensão de célula única. Anteriormente, a análise de murino nervos ciático tem sido difícil devido à pequena quantidade de tecido obtido de cada rato. Além disso, o alto teor de gordura da mielina em torno dos axônios dificulta a recuperação da célula e produz grandes quantidades de detritos. O método aqui descrito para a preparação de nervo ciático e digestão foi adaptado a partir do protocolo de isolamento de célula de Schwann de Barrette et al 7e tem como objetivo isolar células suficientes de nervos de ratos individuais para análise de citometria de fluxo, a fim de reduzir a variação entre ratos. Usar o DAPI para a identificação de células únicas na digest cru tecido contorna a necessidade de remover os resíduos do axônio, que geralmente leva a perda de células. Lavar várias vezes com um aids reserva rica em detergente na liberação de células preso dentro os detritos gordurosos, aumentando assim o rendimento. Digestão de ambos os nervos ciático completos de um único rato de acordo com este protocolo gera ≥ 30, 000 eventos nucleados único e pelo menos 3 vezes esse número foi obtido o DRG. A proporção de CD45+ leucócitos foi de aproximadamente 5% do conteúdo da célula total em digerir o nervo ciático e aproximadamente 5-10% na digest DRG. A maioria da CD45+ células no nervo ciático expressaram os marcadores do macrófago, CD68 e CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os nervos ciático contêm uma grande proporção de lipídios, como colesterol, devido ao teor de mielina em torno dos axônios. Desde que as propriedades de lipídios mudam com a temperatura, diferentes resultados podem ser obtidos em temperaturas diferentes. Para garantir a preservação de células, todas as etapas neste protocolo após a digestão foram realizadas no gelo. Enquanto a consistência é recomendada por razões de reprodutibilidade dos resultados, pode ser possível aumentar o rendimento executando as e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Os autores gostaria de agradecer a Axel Erhardt para execução da maioria da dissecação e prestativamente transmitindo esse conhecimento e Dr. Volker Eckstein para auxiliar no aspecto técnico do citômetro de fluxo.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neurosciences. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
