Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии
Summary
Количественный анализ содержимого ячейки в пределах мышиных седалищного нерва трудно из-за нехватки ткани. Этот протокол описывает метод для ткани пищеварения и подготовки, которая обеспечивает достаточную клетки для анализа потока цитометрии иммунных клеток населения от нервов отдельных мышей.
Abstract
Иммунные клетки нерва резидент в периферической нервной системы (ПНС) имеют важное значение для поддержания целостности нейронов в здоровой нерва. Иммунные клетки ПНС страдают от травм и болезней, влияющих на функции нервов и способности к регенерации. Нейрональные клетки иммунной системы обычно анализируются иммунофлюоресценции (если). А если это важное значение для определения местоположения иммунные клетки нерва, если только полуколичественного и метод ограничивается количество маркеров, которые могут быть одновременно исследовано и степень поверхности выражения. В этом исследовании проточной цитометрии был использован для количественного анализа лейкоцитарной инфильтрации в седалищного нервов или спинной корень ганглиев (ДРГ) отдельных мышей. Был проведен анализ одной ячейки, используя DAPI и некоторые белки были проанализированы одновременно для поверхности или внутриклеточных выражения. Обе седалищного нервов от одной мыши, которые рассматривались согласно протоколу созданы ≥ 30.000 один ядерных событий. Количество лейкоцитов в седалищного нервов, определяется выражением CD45, был около 5% от содержания общей ячейки в седалищный нерв и примерно 5-10% в DRG. Хотя этот протокол фокусируется главным образом на иммунных клеток населения в рамках ПНС, гибкость проточной цитометрии измерить количество маркеров одновременно означает, что население клетки, находящиеся в нерва, например Шванновские клетки, pericytes , фибробластов и эндотелиальных клеток, могут также быть проанализированы с помощью этого метода. Поэтому этот метод предоставляет новые средства для изучения системных эффектов на ПНС, таких как neurotoxicology и генетической модели нейропатии или хронических заболеваний, таких как диабет.
Introduction
Иммунные клетки, которые заходят ПНС из обращения, как определяется выражением CD45 и CD11b, помогают поддерживать целостность нерва и играть определенную роль в регенерации и дегенерации1. Макрофаги (определяется их выражение CD68 мыши) может перекос в сторону воспалительных фенотип, выражая больше MHC класса II и CD86 на их поверхности (M1), или к противовоспалительным фенотипа, выражая более внутриклеточных CD206 (м2)2 . Наклон макрофагов фенотипа представляет собой динамичный процесс, регулируется через Akt сигнализации3, отражающий различные задачи макрофагов в обороне против патогенов (M1) и роль в регенерации тканей (м2). Регенерация потерпевшего нерва сначала требует фагоцитоза миелина мусора макрофагами в нерв4,5и противовоспалительными (CD68+CD206+) м2 макрофагов, было показано, содействовать аксона нарост в ПНС6. Сокращение вербовки или макрофагами к ПНС, или нарушение способности для фагоцитоза может привести к нарушения регенерации и поддержание целостности нерва. Воспалительные M1 макрофагов, выражая гистосовместимости, менее способны фагоцитоза чем м2 макрофагов, и нейрональных воспаление вовлечено в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний7.
Изменения, которые происходят для резидентов иммунной системе нерва вследствие повреждения могут быть количественными, проявляется в потере CD45+ лейкоциты (или увеличить проникновение CD45+ лейкоциты в случае воспаления), или качественной, такие как изменение фенотипа макрофагов с м2 для M1 фенотип. Иммунные клетки ПНС традиционно были проанализированы с помощью если, использование замороженных секций или парафин врезанных материала8. Если требуется для определения локализации клеток интерес. Однако количественная оценка с использованием если часто опирается на подсчет сравнительно небольшое количество клеток в узкой части ткани, делая количественной оценки, ненадежны и подвержены систематическая. Для идентификации конкретных подмножеств иммунных клеток одновременного обнаружения внеклеточные и/или внутриклеточных маркеров требуется, в то время как определение фенотипа макрофагов, требует по крайней мере по крайней мере двух маркеров, специально CD206 и MHC класс II. Как чаще всего доступны Микроскопы ограничены по крайней мере двух цветовых каналов, таких как флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и фикоэритрин (PE), квалификация определенных подмножеств иммунных клеток, если может быть ограничительным и неполными, требующих необходимость иметь несколько слайдов, полученные из той же области интереса, которые витражи и проанализированы параллельно. Этот аспект требует много времени, поэтому не необходимости поддается анализу комплектов больших образцов. Кроме того поскольку большинство из маркеров интерес внеклеточная, обнаружения в ткани, который либо встроен в парафин или криоконсервированных, может быть проблематичным из-за нарушения целостности мембраны и маскировки epitopes, а также потери антигены интерес от использования растворителей, например, ацетон и метанола9.
В противоположность этому, проточная цитометрия, который измеряет оптических и флуоресценции характеристики единичных клеток в суспензии, как они проходят через луч света, обеспечивает более практическим и комплексным средством для анализа клеточных популяций. Проточной цитометрии, вместо того, чтобы производить цифровое изображение ткани, обеспечивает автоматизированный количественная оценка установленных параметров, которые включают относительный размер ячейки и отражающая индекс, называют вперед точечной (FSC), гранулярность/внутренние сложности или сторона точечной (SSC) и относительной флуоресценции интенсивности, обеспечивая, что ячейки был назван с соответствующей Флюорофор, таких как конъюгированных антител. Типичная проточный цитометр состоит из двух, воздушного охлаждения лазеров; Аргоновый лазер производит синий свет в 488 нм и гелий неоновый лазер производит свет в 633 нм. Эта комбинация позволяет для обнаружения и измерения, одновременно, по крайней мере пять целей на поверхности или внутри внутриклеточного отсек. Более продвинутые цитофлуориметрами поток может состоять из нескольких лазеров, которые позволяют для обнаружения до восьми различных флуорохромов одновременно, обеспечивая, что пик выбросов волн выбранного флуорохромов значительно не перекрываются.
Для анализа подачей cytometry, ткани интерес должны сначала быть ферментативно переваривается, обычно с коллагеназы, чтобы генерировать одну ячейку подвеска. Анализ мышиных седалищного нервов ранее был затруднен из-за небольшого количества ткани, полученные из каждой мыши. Кроме того высокое содержание жира миелина вокруг аксоны препятствует восстановлению клеток и производит большое количество мусора. Метод, описанный здесь для подготовки седалищного нерва и пищеварение было адаптировано из клеток Шванн изоляции протокола заколка et al. 7и стремится изолировать достаточно клетки от нервов отдельных мышей для анализа цитометрия потоков, с тем чтобы уменьшить различия между мышей. С помощью DAPI для идентификации одного клеток в сырой ткани дайджест обходит необходимость удаления мусора аксона, который часто приводит к потере клеток. Стиральная несколько раз с моющих средств богатые буфера СПИДом в выпуске клеток в ловушке внутри жирной мусора, тем самым увеличивая урожайности. Пищеварение обеих полнометражного седалищного нервов от одной мыши согласно протоколу генерирует ≥30, 000 одной ядерных событий и по крайней мере 3 раза это число было извлечено от DRG. Доля CD45+ лейкоциты был приблизительно 5% из всего содержимого в дайджест седалищного нерва и примерно 5-10% в дайджест DRG. Большинство CD45+ клетки в седалищный нерв выразили маркеры макрофагов, CD68 и CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Седалищный нервы содержат большое количество липидов, таких как холестерин, благодаря содержанию миелина вокруг аксоны. Поскольку с температуры изменяются свойства липидов, различные результаты могут быть получены при разных температурах. Для обеспечения сохранения клеток, на льду б…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Авторы хотели бы поблагодарить Axel Erhardt для выполнения большинства диссекции и услужливо передачи этих знаний и д-р Фолькер Eckstein для оказания помощи в техническом плане проточный цитометр.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neurosciences. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
