Summary
I manuskriptet beskriver vi bruk av en gjær-baserte fluorescens reporter analysen identifisere cellulære komponenter involvert i smugling og drepe prosesser av den cytotoksiske en undergruppe til anlegget gift Risin (RTA).
Abstract
Bakteriell og plante A / B giftstoffer utnytte naturlige menneskehandel stier i eukaryote celler å nå deres intracellulær målet (r) i stoffer og til slutt drepe. Slike A / B giftstoffer består vanligvis av en enzymatisk aktive Asubunit (f.eks, Risin gift en (RTA)) og én eller flere celle bindende Bsubunit(s), som er ansvarlig for gift binding til bestemte cellen overflate reseptorer. Vår nåværende kunnskap om hvordan A / B giftstoffer er i stand til å effektivt berusende celler hjalp forskere for å forstå grunnleggende cellulære mekanismer som endocytose og intracellulære protein sortering i høyere eukaryote celler. Fra et medisinsk ståsted er det også viktig å identifisere store gift smuglerrutene finne adekvat behandling løsninger for pasienter eller senere utvikle terapeutiske gift-baserte applikasjoner for kreft terapi.
Siden genomet hele analyser av A / B gift menneskehandel pattedyrceller er komplekse, tidkrevende og kostbare, flere studier på A / B gift transport er utført i gjær modell organismen Saccharomyces cerevisiae. Tross mindre kompleks, grunnleggende cellulære prosesser i gjær og høyere eukaryote celler kan er like og ofte resultatene i gjær overføres til pattedyr situasjonen.
Her beskriver vi en rask og enkel å bruke reporter analysen å analysere intracellulær smugling av RTA i gjær. En viktig fordel med nye analysen er muligheten til å undersøke ikke bare RTA retro-translokasjon fra det endoplasmatiske retikulum (ER) stoffer, men heller endocytose og retrograd gift transportere fra plasma membranen til ER. Analysen gjør bruk av en reporter plasmider der indirekte måling av RTA toksisitet gjennom fluorescens utslipp av grønne fluorescerende protein (GFP) etter i vivo oversettelse. Siden RTA effektivt hindrer oppstart av protein biosyntesen av 28S rRNA depurination, kan denne analysen identifikasjon av verten celle proteiner involvert i intracellulær RTA transport gjennom påvisning av endringer i fluorescens utslipp.
Introduction
Pasienter som lider av infeksjon med toksin-produserende bakterier representerer en alvorlig medisinsk og økonomisk byrde for hver sosiale helsevesenet, spesielt siden effektiv terapeutiske behandlinger er fortsatt i stor grad mangler. Å utvikle nye strategier, komplekse rus mekanismer av medisinsk relevante A / B giftstoffer som kolera gift, Shiga gift eller Risin må være fullt ut forstått på molekylært nivå basert på romanen kraftige analyser som må implementeres.
De siste årene har flere studier forsøkte å analysere A / B gift transport i gjær og pattedyrceller ved hjelp av tid- og kostnadskrevende metoder som radioaktivt gift merking1,2 , samt siRNA-basert screening tilnærminger3. I noen tilfeller har gift menneskehandel vært visualisert i vivo av fluorescens mikroskopi etter kjemiske og/eller genetisk koblingen av personlige gift underenheter med fluorophores, kvante prikker eller fluorescerende proteiner4,5. Dessverre føre slike endringer ofte til inaktive og/eller endrede naturlige egenskaper av giftstoffer. Elegante indirekte svare mange vitenskapelige spørsmål er bruk av reporteren systemer basert på enzymer som lacZ, luciferase eller fluorescerende proteiner (f.eks GFP eller Discosoma sp. røde fluorescerende protein ( dsRed)).
I dette manuskriptet er en enkel protokoll beskrevet som identifiserer cellulære komponenter kreves for intracellulær transport av extracellularly anvendt RTA i S. cerevisiae. Dermed fungerer en fluorescens-reporter plasmider inneholder et N-terminal ER import signal etterfulgt av GFP som en protein biosyntesen sensor, hvilke indirekte måler RTA-mediert protein oversettelsen hemming av GFP fluorescens utslipp etter i vivo oversettelse6. I tilfelle at RTA endocytose og/eller intracellulær handel (positivt eller negativt) påvirkes i en bestemt gjær sletting mutant sammenlignet med vill-type, kan dette være oppdaget gjennom en øke (eller nedgang) i GFP fluorescens utslipp6.
Så langt, var alle metoder analysere RTA transport i gjærceller begrenset til ER-å-stoffer retro-translokasjon prosessen med RTA. En kunstig systemet uttrykkes RTA inneholder et ER import signal fra en induserbart arrangøren som resulterer i en suicidal fenotypen1,7. Selv om cellen bindende B-delenhet i Risin er likeledes mangler i eksperimentell oppsettet beskrevet i dette manuskriptet, og dermed ikke helt representerer den naturlige situasjonen Risin holotoxin rus8, gift transport fra plasma membran gjennom Golgi apparatet til ER kan bli tett etterlignet med denne romanen analysen. Interessant, indikerer de foreløpige resultatene fra pilotstudien at menneskehandel veier brukt av RTA avsløre slående likheter med rus ruten Risin holotoxin.
Oppsummert kan metoden beskrevet brukes til å fastslå den spesifikke-rollen valgte mobilnettet proteiner i RTA endocytose og smugling av gjær. Videre kan eksperimentell installasjonen lett tilpasses andre ribosom inaktivere giftstoffer produsert og skilles ut fra ulike gjær og bakteriell arter som zymocin eller Shiga gift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: En oversikt over den generelle eksperimentelle arbeidsflyten er avbildet i figur 1.
Forsiktig: RTA er svært giftig for mennesker. Sikkerhet lab tillatelse S2 (biosikkerhet nivå 2 tilsvarer) er nødvendig. Vennligst bruk hansker under hele eksperimentet.
1. heterologous uttrykk for hans-merket RTA i Escherichia coli
- Transformere E. coli celler med uttrykket plasmider pET24-RTA(hans) 6 eller tom vektor pET24a(+) ved hjelp av standard electroporation protokoller9,10. Celler med tomme plasmider tjene som en negativ kontroll.
- Etter valg av positiv kloner på kanamycin inneholder (100 µg/mL) LB plater, vaksinere cellene som inneholder RTA uttrykk plasmider eller tom vektoren i 5 mL LBkan medium (LB medium med 100 µg/mL kanamycin) og ruge på 37 ° C og 220 rpm for 24 timer.
- Tillegg 1 L LBkan middels med 5 mL pre kultur og ruge cellene på 37 ° C og 220 rpm til celler har nådd et OD600 0,8-1,0 (ca 3-4 h). Deretter redusere kultur temperaturen til 28 ° C og forberede en 1 M isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) lager løsning i H2O.
- Indusere RTA uttrykk av E. coli ved å legge IPTG til en siste konsentrasjon av 1 mM.
- 3,5 h på 28 ° C og 220 rpm, høste celler med sentrifugering på 10.000 x g og 4 ° C i 10 min, vaskes pellet to ganger med 5 mL bindende buffer (500 mM NaCl 10 mM imidazole og 20 mM KH2PO4 pH = 7.4) på 10.000 x g og 4 ° C for 10 min og resuspend pellets 5 mL bindende buffer.
Merk: Protokollen kan pauses på dette stadiet og celler kan lagres på 80 ° C i flere dager.
2. rensing av hans-merket RTA via affinitet kromatografi
- Sonicate celler i isen ved hjelp av følgende protokollen: 15 s puls (20 mikron), 30 s pause. Gjenta dette trinnet fem ganger.
- Sentrifuge celle lysate på 21000 x g og 4 ° C i 15 min og filtrere nedbryting bruker sterile sprøyter filtersystem (0,2 µm porestørrelse).
Merk: Cellen pelleter av vellykket sonicated prøver viser gjennomsiktig grenser. - Bruke en automatisert rensing system utstyrt med et 5 mL Ni2 +-basert affinitet kolonne for å rense hans-merket RTA brøken fra den sterile-filtrert E. coli supernatant. Generelt, bruk en elueringsrør hastighet på 1 mL/min og kul hele rensing systemet for å hindre ikke-effektiv gift bindende og tap av gift aktivitet.
Merk: Parametere for effektiv RTA rensing er oppført i tabell 1. Se også Becker et al. for ytterligere informasjon9.- Kort, equilibrate kolonnen affinitet med 20 mL bindende buffer fjerne lagringsplass bufferen. Bruke sterilt-filtrert nedbryting på kolonnen affinitet bruker en sprøyte.
- Vask kolonnen med 25-35 mL bindende buffer fjerne ubundet proteiner fra kolonnen. Utfør vask trinn til UV absorbans ved 280 nm ligger UV startverdien.
- Elute bundet RTA fraksjon i 20-35 mL elueringsbufferen (500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7.2) og holde prøven på is (figur 2A og 2B figur).
Merk: Elueringsrør RTA brøkdel er preget av en økning i UV absorpsjon. Vær oppmerksom på å kun samle denne fraksjonen for å hindre forurensning med uspesifikke bundet proteiner. - Bruk 20 µL av elut prøver for å utføre Coomassie blå flekker11 eller Western blot analyse12,13 (valgfritt). Bruke primære anti-hans antistoffer (1:1, 000) og sekundær anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) oppdage RTA og kontrollere prøven renhet (Figur 3).
- Desalt elut RTA brøk i en 5 mL avsalting kolonne og equilibrate utvalg i 0,8 M sorbitol.
- Erstatt kolonnen affinitet av ordningen med renselse av kolonnen avsalting og første equilibrate kolonnen med 20 mL 0,8 M sorbitol.
- Bruke eluted RTA brøken kolonnen via en sprøyte. Vask kolonnen med 100 mL 0,8 M sorbitol og elute avsalte RTA brøken i en 15 mL tube UV opptaket starter å øke (figur 2C).
- Lagre eluted RTA brøken på 4 ° C.
NOTE: Opphøre direkte RTA brøkdel prøvetaking når konduktans øker for å unngå salt forurensning. Parametere for avsalting prosedyren er oppført i tabell 1.
- Konsentrere elut RTA brøkdel 10.000 x g og 4 ° C i 30-180 min bruker en 10 kDa cut-off spinn kolonne til et siste volum 1-2 ml og lagre eksempel på 4 ° C i 3-4 uker.
Forsiktig: Frys prøven siden frysing fører til fullstendig tap av RTA aktivitet. - Bestemme protein konsentrasjonen med en konvensjonell protein besluttsomhet kit. Protein konsentrasjon bør være i området 1-1,5 mg/mL.
Merk: RTA tendens til å føre hvis protein konsentrasjonen er for høy (> 5 mg/mL).
3. gjær transformasjon og cellevegg fjerning
- Transformere vill-type eller valgte gjær sletting mutanter med GFP reporter plasmider pRS315-K28SP- GFP6 Bruk standard litium acetate transformasjon metoder14. Inkuber celler i leucine frafallet (d/o) glukose plater (2% glukose, 1,5% agar, 0,5% ammonium sulfate, 0,17% gjær Nitrogen Base (YNB) og 0.087% d/o blanding uten leucine) på 30 ° C i 2-3 dager for positiv klone utvalg.
- Velg 3 ulike gjær kloner fra hver plate og vaksinere kloner i 100 mL leucine d/o raffinose middels (2% raffinose 0,5% ammonium sulfate, 0,17% YNB og 0.087% d/o bland uten leucine) ved 220 rpm og 30 ° C OD600 = 1,0 til 2,0 (2-4 x 107 celler/mL).
Merk: Cellevekst av ulike gjær sletting stammer er forskjellig. Overvåke OD600 via et spektrofotometer. - For å beregne OD600 verdier, fortynne prøver OD600 = 0.1-0.3 (1:5 til 1:10 fortynninger) og måle OD600 i et spektrofotometer. Bruk H2O supplert med tilsvarende beløp av leucine d/o raffionose medium som referanse.
- Etter endt trinn 3.5, blande 4 µL av spheroplasted 50 mL kultur med 496 µL spheroplasting buffer (ca 2 × 106 spheroplasts) og sentrifuge for 10 min 400 x g.
- Resuspend pellets i 10 mL H2O destillert, vortex utvalg for 30 s og plate ut 10 µL av utvalget på leucine d/o glukose plater (2% glukose, 1,5% agar, 0,5% ammonium sulfate, 0,17% YNB og 0.087% d/o blanding uten leucine).
- Inkuber celler for 3 dager på 30 ° C. Telle antall voksen cellen kolonier på tallerkenen. For data evaluering, kan du bruke bare prøver med effektivitet høyere enn 98% (totalt celle kolonien nummer < 40 koloniene/plate).
4. GFP Reporter analysen måling i 96-brønnen plater
- Ætt ut gjær celle spheroplasts fikk i trinn 3.7 i 96-brønnen platene (200 µL/vel).
- Legge til 70 µL stabilisert leucine d/o raffinose medium som inneholder negative kontroll (eluate av en Ni2 +-affinitet renset celle lysate fra IPTG-indusert E. coli celler uttrykke tom vektoren) eller renset RTA i en siste RTA konsentrasjon på 5 µM ( tilsvarende 160 g/L RTA) i hver brønn.
- Straks legge 30 µL stabilisert galaktose løsning (30% galaktose, 0,8 M sorbitol) for å indusere GFP uttrykk og deretter starte målingen.
Merk: Utfører minst 3 teknisk gjentak per forsøk og 3 biologiske replikerer per gjær belastninger. - Etter endt eksempel forberedelse (trinn 4.1-4.3), setter 96-brønns platen i en fluorescens leser og starte målingen. Bruk 475/509 nm filtersettet kreves for GFP fluorescens gjenkjenning. Utføre målinger ved 30 ° C, 120 rpm, og med risting diameter 1 mm over et tidsvindu 20 h (måle intervaller på 10 min).
Merk: Hvilke GFP filteret er vanligvis tilgjengelig i alle leser systemer. Temperatur, tidsvinduet, måle intervaller og RTA konsentrasjon kan justeres for eget behov. Representant resultater er vist i Figur 4. - Valgfritt: Bruk flere interne kontroller i målingen for kvalitetskontroll. Forberede en negativ kontroll ved å legge 30 µL stabilisert leucine d/o raffinose medium i stedet for 30% galaktose (ingen GFP induksjon). I tillegg legge 70 µL av 0,8 M sorbitol stabilisert G418 løsning (300 µg/mL). Den protein oversettelse inhibitor G418 fungerer som positive kontroll for protein hemming som hindrer GFP uttrykk i gjær.
- Beregne relative GFP fluorescens i prosent for 20 h tidspunktet i henhold til denne formelen (se figur 4A):
der NC er kontrollen negative
- Eventuelt bestemmer den relative GFP fluorescensen for hver måling point (i dette tilfellet 10 min, se trinn 4.4) bruker over ligningen. Som vist i figur 4B, kan du opprette et diagram ved blotting GFP fluorescens intensiteter (y-aksen) over tid (x-aksen).
der NC er kontrollen negative
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle arbeidsflyten av protokollen beskrevet i dette manuskriptet er illustrert i figur 1, omtrent oppsummerer enkelt trinnene for vellykket RTA rensing og påfølgende GFP reporter analysen eksperimentet. Du finner en mer detaljert beskrivelse av hvert trinn i protokollen. Figur 2 viser forventede resultatet av en vellykket RTA rensing av affinitet kromatografi (figur 2A) og tom vektor kontroll (figur 2B). Figur 2C viser en representant utfallet av en avsalting eksperiment illustrerer perfekt separasjon av protein toppen (blå) og salt-elut toppen (brun). En effektiv RTA rensing er presentert i form av en Coomassie-farget SDS-gel i Figur 3. Til slutt, Figur 4 oppsummerer noen originale resultatene av denne enkel og robust GFP-baserte reporter analysen metode6. Figur 4A illustrerer at etablerte GFP reporter analysen er stand til å produsere pålitelige resultater og skjematisk viser GFP reporter plasmider brukt i denne studien. I grafen, er den relative GFP fluorescensen av gjær spheroplasts under RTA-behandlet og ikke-behandlet forhold sammenlignet med hverandre. Som forventet, Vis ikke-indusert samt G418-behandlet celler nesten ingen GFP fluorescens. I ikke-behandlede og negative kontroll-behandlet (tom vektor) celler, GFP uttrykk er ikke berørt og betydelige forskjeller mellom begge prøver ble ikke observert. Derimot fører RTA behandling til forventet GFP fluorescens reduksjon formidlet av sin ribosom hemme aktivitet. Figur 4Bvises en gang kurve av RTA-indusert GFP fluorescens hemming. Denne typen data presentasjon inneholder tilleggsinformasjon om tidspunktet GFP uttrykk (90 min etter galaktose induksjon) og utgangspunktet for translasjonsforskning hemming av RTA (210 min etter søknad i vill-type celler). Forsinkelsen i RTA-mediert fluorescens nedgang sannsynligvis reflekterer opptak kinetics og intracellulær transport av RTA stoffer. Figur 4C illustrerer den relative GFP fluorescensen hentes fra utvalgte gjær mutanter etter en 20 h RTA-behandling sammenlignet RTA-behandling og sammenlignet RTA-behandlet vill-type celler. ERAD komponentene Hrd1p og Der1p ble valgt som passer positiv kontroller fordi tidligere studier allerede vist at begge proteiner er involvert i ER-å-stoffer retrotranslocation av RTA i gjær1. Derfor viser både mutanter den forventede økningen i GFP fluorescens sammenlignet med vill-type celler. Sammenligning er relative GFP fluorescens verdier i Δyos9 og Δnup120 celler ikke vesentlig forskjellig. Det har allerede blitt beskrevet at verken mangel ER kvalitetskontroll Lektiner Yos9p eller mangel i kjernefysiske pore protein Nup20p påvirker RTA toksisitet og transport1. En liste over parameterne spesifikk affinitet kromatografi og avsalte kan finnes i tabell 1.
Figur 1: generelle arbeidsflyten av RTA rensing og GFP-baserte reporter analysen. RTA rensing (venstre) starter med transformasjon av E. coli med uttrykket eller tom vektor etterfulgt av dyrking og IPTG-indusert RTA uttrykk. Etter celle lyse og sterile-filtrering, nedbryting er renset via Ni2 + affinitet kromatografi og prøve renhet kontrolleres via Coomassie flekker eller Western blot. Før eluted RTA fraksjoner er klar til bruk i GFP reporter analysen eksperimentet, brøker må avsalte og konsentrert og protein konsentrasjon må bestemmes. GFP reporter analysen eksperimentet (høyre) starter med transformasjon av vill-type og/eller valgte gjær sletting mutanter med den GFP uttrykk konstruere. Etter dyrking fjernes cellen vegg av enzymatisk behandling å tillate RTA i vivo opptak. Deretter GFP fluorescens av gjær celle spheroplasts måles under gift-behandlet og ikke-behandlet over tid i en fluorescens leser (475/509 nm). Til slutt, relativ GFP fluorescens bestemmes ved hjelp av formelen vises i trinn 4.6 og vises som vist i Figur 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant affinitet kromatografi og avsalte resultatene av E. coli cellene som inneholder pET-RTA(hans) 6 eller tom vektor kontroll. (A) vanlig rensing graf en E. coli celle lysate prøve uttrykke RTA(hans) 6 fra vektor pET24-RTA(hans) 6. Blå kurve representerer UV opptaket på 280 nm forårsaket av aromatiske ringene av aminosyrer Trp og Tyr Cys og fungerer som protein indikator. Under kolonne lasting oppdages ubundet proteiner i flyt-gjennom (0-10 mL). Etter fjerner ubundet proteiner ved å vaske med bindende buffer, elueringsrør buffer konsentrasjon er økt fra 0 til 100% (rød kurve) og bundet proteiner er umiddelbart elut fra kolonnen. Toppen av blå kurven mellom 25 og 30 mL representerer brøkdel av bundet hans-merket RTA (svart boks). (B) vanlig rensing graf en E. coli lysate fra celler uttrykke tom vektor kontroll. Samme rensing protokoll som (A). Som vist i den svarte boksen, er ingen proteiner elut fra kolonnen i kontrollen negative. (C) Desalting diagram av en E. coli pET24-RTA(hans) 6 prøve etter affinitet rensing. Diagrammet viser separasjon av RTA protein fraksjon (peak 280 nm absorpsjon mellom 20-30 mL) og salt brøken (økende konduktans topp etter 30 mL).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant Western analyse av forskjellige prøver før og etter affinitet rensing. 20 µL celle lysate (baner 2-4) eller renset utvalg (baner 5-7) av ulike RTA varianter (bare uforandret RTA ble brukt i denne studien) analysert av SDS side og Coomassie blå flekker. Lane 1, protein stigen; kjørefelt 2, uforandret RTA; Lane 3, RTAHDEL; Lane 4, RTAKDEL; Lane 5, uforandret RTA; Lane 6, RTAHDEL; Lane 7 RTAKDEL. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultatene av reporteren analysen for RTA-behandlet vill-type og valgte gjær sletting mutanter. (A) Relative GFP fluorescens av vill-type gjær spheroplasts som inneholder den reporter plasmider pRS315-K28SP- GFP (til høyre) under indusert (3% galaktose, GFPind.) og ikke-indusert (2% raffinose, GFPrepr.) tilstander etter 20 h GFP induksjon. Relativ GFP fluorescens var også analysert i nærvær av RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) eller kontrollen negative (NC). Den protein oversettelse inhibitor G418 fungerer som positive kontroll og hindrer GFP uttrykk i gjær. Mean verdier og standardavviket (SD) angis. (B) Relative GFP fluorescens fra (A) vises som tid kurs over 20 h. Dette diagrammet gir tilleggsinformasjon om tidspunktet for GFP uttrykk og oversettelse hemming av RTA; kurven atferden reflekterer indirekte the kinetics av RTA opptak og intracellulær transport til stoffer. (C) representant resultatet av utvalgte gjær mutanter defekt i mobilnettet proteiner som er kjent for å være involvert (Hrd1p og Der1p) eller ikke involvert (Yos9p og Nup120p) i RTA menneskehandel gjær1,6. Den stiplede linjen representerer en terskel av betydning som er basert på fluorescens utslipp ved de positive kontroll stammene (se referanse6ytterligere forklaring). Mean verdier og standardavviket (SD) angis. Figuren ble endret fra Becker et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Affinitet chromotography parameter | ||
| Måle parametere | UV (280 nm), elueringsrør buffer konsentrasjon, konduktans | |
| Innstillinger | Variabel/enhet | Verdi |
| Gjennomstrømning | mL/min | 1 |
| Maksimal kolonnen press | MPa | 0,35 |
| Bølgelengde | NM | 280 nm |
| Bindende buffer | Pumpe posisjon | A |
| Elueringsbufferen | Pumpe posisjon | B |
| Start konsentrasjon-elueringsbufferen | % | 0 |
| Systemet volum kompensasjon | mL | 10 |
| Kolonnen balanse | mL | 20 |
| Eksempel injeksjon over superloop/sprøyte | mL | celle lysate volum |
| Vask trinn | mL | 20-35 |
| Elueringsrør trinn | mL | 20-35 |
| Konsentrasjon elueringsbufferen under elueringsrør | % | 100 |
| Rekalibrering kolonnen med 20% EtOH | mL | 50 |
| Avsalting parameteren | ||
| Måle parametere | UV (280 nm), konduktans | |
| Innstillinger | Variabel/enhet | Verdi |
| Gjennomstrømning | mL/min | 4 |
| Maksimal kolonnen press | MPa | 0,35 |
| Bølgelengde | NM | 280 nm |
| Bindende buffer | Pumpe posisjon | A |
| Elueringsbufferen | Pumpe posisjon | B |
| Start konsentrasjon-elueringsbufferen | % | 0 |
| Systemet volum kompensasjon | mL | 10 |
| Kolonnen balanse | mL | 20 |
| Eksempel injeksjon over superloop/sprøyte | mL | celle lysate volum |
| Avsalte buffer injeksjon (0,8 M sorbitol) | mL | 100 |
| Rekalibrering kolonnen med 20% EtOH | mL | 50 |
Tabell 1: parametere brukt for kolonne-baserte affinitet rensing og avsalte. Liste over alle relevante kolonneinnstillinger (f.eks, flyt, elueringsrør buffer konsentrasjon, balanse og vask trinnets varighet) og målte parametere (f.eks, konduktans eller UV absorpsjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du utfører ovenfor protokollen, anbefaler vi følgende forslag å oppnå et vellykket resultat av eksperimentet.
For heterologous protein uttrykk er det viktig å ikke overskride IPTG konsentrasjonen av 1 mM. IPTG konsentrasjoner > 1 mM hemme selskapet-indusert RTA uttrykk og føre til lavere gift gir. Videre være celler ikke dyrket ved temperaturer høyere enn 28 ° C å hindre inkludering kroppen formasjon, ineffektiv bretting og gift inaktivering. RTA uttrykk ved lavere temperatur (f.eks, 20-28 ° C) er mulig og også fører til produksjon av biologiske aktive gift. Men den ekstra temp.senkning vesentlig forbedrer ikke RTA aktivitet/folding og resulterer i en lavere totale gift avkastning sammenlignet med 28 ° C (data ikke vist).
Rensing parametere av affinitet kromatografi (tabell 1) er optimalisert for bruk av et automatisert rensing system utstyrt med 5 mL Ni2 + affinitet kolonne og skal justeres til andre hjemmelaget eller kommersielle systemer hvis RTA renhet og avkastning er sub-optimale. I sub-optimale RTA renhet (angitt av utseendet på ekstra proteiner i Coomassie-farget SDS-gelé), reduserer en økning i imidazole konsentrasjonen av bindende bufferen normalt uspesifikke binding av positivt ladede proteiner til den kolonne, og dermed øke total RTA renhet. I sub-optimale RTA gir, innføring av ytterligere sonification trinn (4-8 pulser), lengre inkubasjon ganger (5 h) eller større kultur volumer (> 1 L) kan bidra til å forbedre generelle gift avkastningen. Men det er også muligheten til å kunne rense RTA via spinn kolonne basert systemer (data ikke vist) Hvis et automatisert system ikke er tilgjengelig i laboratoriet.
Under det avsalting trinnet er det viktig å hoppe prøvetaking prosedyren så snart konduktans begynner å stige. Forurensning med salt, spesielt imidazole, påvirker protein konsentrasjon målingen, resulterer i unøyaktig RTA konsentrasjon beslutning som direkte påvirker RTA innholdet i GFP reporter analysen.
Det er viktig å lagre renset RTA på 4 ° C og unngå frysing. Frosne prøvene viser en redusert aktivitet av RTA i XTT-baserte celle vitalitet analyser på HeLa celler (data ikke vist). Renset prøver kan holdes for ca 3-4 uker før deres biologiske aktivitet er kontinuerlig redusert. I tillegg er høye RTA konsentrasjoner (≥5 mg/mL) etter spinn kolonnen konsentrasjon avgjørende fordi RTA viser en tendens til å føre i 0,8 M sorbitol.
En ulempe metoden er at RTA er normalt ikke tatt opp av intakt gjærceller. For å oppnå pålitelige resultater, må gjær cellevegg fjernes helt ved enzymatisk behandling. Derfor er det viktig å sjekke spheroplast formasjon effektiviteten til hver gjær belastninger av metodene beskrevet i trinnene 3.4-3,5. I sub-optimale spheroplast forberedelse, bør inkubasjonstiden og lytisk enzym konsentrasjon optimalisert og overvåkes via fase kontrast mikroskopi. Overdigestion (ghost formasjon) kan forebygges ved å redusere lytisk enzym konsentrasjon og/eller inkubasjon tid mens det motsatte tilnærmingen er nødvendig hvis mangelfull fordøyelsen. Data fra stammer med utilstrekkelig cellevegg fjerning bør utelukkes fra data evalueringen.
Det bør også nevnes at eksperimentelle oppsettet ikke etterligne helt naturlig rus prosessen med Risin. Cellen bindende B delenhet i Risin (RTB) mangler som er vanligvis ansvarlig for effektiv gift binding til galaktose rester på celleoverflaten pattedyrceller15. Teoretisk sett kan denne begrensningen overvinnes ved å utføre eksperimentet med renset Risin holotoxin med sin A og B delenhet. Likevel har gjærceller ikke galaktose rester på celleoverflaten deres som kan megle binding av RTB8; Dette forklarer også hvorfor intakt gjærceller er ikke følsom mot Risin. Dermed er det uklart om RTB ville fungere som celle bindende komponent i gjær modellen. Interessant, vist tidligere studier allerede at RTA er kjøpedyktig rekkevidde stoffer av pattedyrceller uten cellen bindende B delenhet16. For å forstå dette fenomenet, besluttet vi å bruke bare RTA i eksperimentell oppsettet for å identifisere cellulære komponenter i gjær som letter gift handel fra plasma membranen i stoffer. Overraskende, viser komponentene i RTA handel med gjær slående likheter med de nødvendige komponentene for effektiv Risin holotoxin transport i pattedyrceller6. Basert på disse resultatene, kan det være spekulert at RTB spiller en mindre rolle i intracellulær Risin transport enn tidligere antatt, og er bare viktig for første kontakt til pattedyr celleoverflaten.
Derimot siRNA-baserte systemer i pattedyrceller perfekt reflekterer naturlig gift situasjonen, men er tidkrevende og kostbar3. Videre bruk av gjær sletting mutanter bærer viktig fordel at mutantene Vis en fullstendig knock-out av protein av interesse, mens siRNA-baserte systemer vanligvis føre til en reduksjon av protein nivå. I noen tilfeller kan gjenværende protein nivåer være tilstrekkelig for gift transport der ingen endret fenotypen er observert, og dermed involvering av spesielle proteinet er ikke synlig i siRNA-baserte systemer.
Selv om bare uvesentlig gjær sletting påkjenningen ble brukt i opprinnelige studere6, temperatur-sensitive stammer, samt redusert overflod av mRNA forstyrrelsene (DAmP) samling stammer17 (redusert uttrykk nivå av viktige proteiner) er likeledes egnet for denne type metode i fremtiden. Generelt rollen essensielle proteiner ikke undersøkt med denne analysen fordi levedyktighet, derfor representerer en begrensning av analysen.
Imidlertid, ny reporteren analysen representerer en elegant og alternativ strategi til eksisterende metoder som prøver å analysere RTA transport i modellen organismen S. cerevisiae. Eksisterende studiene brukte intracellulær plasmider-drevet RTA uttrykk systemer og er begrenset til analyse av retro-translokasjon fra ER i stoffer1,7. Vellykket implementering av ekstracellulære RTA programmet nå åpner muligheten til ikke bare studere ER retrotranslocation men også indirekte analysere RTA transport fra PM om Golgi til ER.Cellulære funksjoner og lokalisering av flertallet av gjær gener i dag oppdaget og tilgjengelig i databaser, identifisert kandidat proteinene kan tilordnes direkte til bestemte avdelinger og/eller transport trasé.
Samlet representerer metoden introdusert reporter analysen en enkel og robust tilnærming til å identifisere kandidat proteiner involvert i intracellulær smugling av giftstoffer eller gift underenheter (f.eksRTA) som blokkerer protein oversettelsen i vivo. Relativt lav standardavvik (1-10%) samt høy reproduserbarhet i den opprinnelige studien bekrefter disse påstandene. På grunn av 96-brønns plate format er en rask screening av ulike gjær mutanter mulig innen en dag etter gift rensing.
I fremtiden, er det muligheten til å bruke metoden for høy gjennomstrømming screening av gjær sletting biblioteker. I gjeldende stilling er anvendt RTA konsentrasjonen (5 µM) kjøpedyktig nedgang den relative GFP fluorescensen til 50%. Under disse forholdene tilbyr metoden fordelen for å identifisere sletting mutanter med negative (økt GFP fluorescens) og positiv (redusert GFP fluorescens) effekter på RTA transport. For høy gjennomstrømning screenings er sterkere forskjell behandlet og ikke-behandlet noen ganger nyttig. Bruke høyere RTA konsentrasjoner og/eller øke mål intervallet (f.eks, 48t), bør en enda mer uttalt blokk GFP uttrykk være oppnåelig.
Er det understrekes at denne metoden ikke er bare begrenset for å analysere rus prosessen med ekstracellulære anvendt RTA i gjær, men det er også muligheten til å analysere ER import av RTA ved å uttrykke RTA via en plasmider i denne GFP reporter belastning (data ikke vises). Videre kan screening tilnærming likeledes bli tilpasset for å studere intracellulær transport veier av andre protein biosyntesen hemme proteinene som zymocin18 i fremtiden. I motsetning til godt preget drap modus for zymocin, er relativt lite kjent om menneskehandel veier ansvarlig for effektiv gift transport i stoffer19,20. Dermed representerer zymocin en optimal kandidat for fremtidige studier som zymocin er naturlig tatt opp av gjærceller. Dermed utelates fjerning av cellen vegg som forbedrer den generelle ytelsen til GFP reporter analysen (med hensyn til tid og kostnader). Med hjelp av dette kraftige reporter analysen, ville det være mulig å dissekere intracellulær transport route(s) av zymocin i gjær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Deler av denne studien var vennlig støttes av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
