肿瘤 PD-1 的多路免疫荧光分析及量化研究+ Tim-3+ CD8+ T 单元格
Summary
研究肿瘤微环境可以确定预后或预测的标志物的临床反应免疫治疗。本文介绍了一种基于原位荧光多光谱成像的创新方法, 对 CD8+ T 细胞的各种亚群进行自动分析和计数。这种可重现和可靠的技术适用于大型队列分析。
Abstract
免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分, 在癌变的各个阶段影响肿瘤的生长和进化。值得注意的是, 现在已经证实, 人体肿瘤的免疫渗透可以与预后和治疗反应相关联。对肿瘤微环境中免疫浸润的分析已成为患者分类和治疗反应的主要挑战。
抑制受体的共同表达, 如程序细胞死亡蛋白 1 (PD1; 也称为 CD279), 细胞毒 t 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4), t 细胞免疫球蛋白和含 Protein-3 (Tim-3, 也称为 CD366), 淋巴细胞活化基因 3 (Lag-3, 也称为 CD223), 是 T 细胞衰竭的标志。我们开发了一个多的原位免疫荧光染色, 以确定和量化的细胞水平, 这些抑制受体的共同表达。在回顾性肾细胞癌 (RCC) 冰冻组织中, 应用荧光多光谱成像技术与图像分析软件结合, 发现 PD-1 和 Tim-3 对肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的联合表达与碾压混凝土的预后差相关。根据我们的知识, 这是第一个研究表明, 这种自动复用的原位技术可能有一些临床相关性。
Introduction
在过去的几年中, 免疫治疗已经成为一种非常有前途的疗法, 许多类型的癌症, 包括 RCC。特别是, 基于抑制像 PD-1 和 CTLA-4 等抑制检查站的免疫疗法已被报告为临床有效的1,2,3,4,5,6. 抗 CTLA-4、PD-1 或程序死亡配体 1 (PD-L1) 的单克隆抗体已在几种癌症中获得批准, 并导致20% 以上患者的长期持续临床反应7。然而, 并非所有的病人都是应答者, 治疗的费用很高, 这些治疗是有毒的, 导致潜在的严重的自身免疫性副作用。因此, 当前的挑战是确定那些新的免疫的预测标记。据报道, 肿瘤的突变率, PD-L1 的表达, 或 CD8 细胞浸润的水平, 与临床反应相关.然而, 该协会仍然过于薄弱, 建议在临床实践中使用这些临床生物标志物, 除了在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的 Pembrolizumab 前 PD-L1 的同伴试验,8 ,9,1011,12。结果表明, PD-1、Tim-3、Lag-3 和 CTLA-4 等多种抑制受体的共同表达, 诱导细胞衰竭表型和抗性治疗13,14,15。由于外周血不是肿瘤微环境的代表, 因此, 分析细胞的表型特征原位是很有意义的。PD-1 和 Tim-3 共表达 T 细胞已知是功能受损的细胞在几个上下文13,16,17。在这项研究中, 评估了两个抑制受体 PD-1 和 Tim-3 在 CD8 的 T 细胞上的共同表达对预后的影响.
到目前为止, 研究多标记物在肿瘤浸润淋巴细胞 (til) 中的协同表达主要是通过流式细胞仪分析进行的, 因此有必要对新鲜肿瘤进行研究, 从而排除回顾性分析。与常规的原位染色, 一次只能进行一次染色, 而与表达标记的细胞类型的表征是不可能的。例如, PD-L1 是由肿瘤微环境的许多细胞类型表达的, 使得传统的免疫组织化学分析难以定义 PD-L1 细胞的表达与相关研究的相关性更大。在这项工作中, 我们开发了一个创新的原位多免疫荧光法与计算机计数, 以关联 PD-1 和 Tim-3 的共同表达的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞与临床结果在 RCC。这项技术有几个优点, 包括有可能在一个单一的细胞水平和多个标记同时使用多光谱相机, 可以捕获限制的时间间隔 > 10 nm 通过液晶滤镜18。此外, 该过程是自动的, 使互操作性和缩短分析相比, 手动技术19。在癌症领域, 几项研究报告有说服力的多染色免疫分子如 PD-1, PD-L1, 和 CD8 在默克尔-细胞癌, 肺癌, 头颈癌20,21,22,23. 通过用户的培训 (分步骤), 可以实现自动单元计数。荧光是在不同的细胞室 (细胞核, 细胞质, 和膜) 测量。
在大量的碾压混凝土中, 不同的肿瘤浸润 CD8+ T 细胞表达 PD-1 和/或 Tim-3, 结果与临床重力评分和生存参数相关。在细胞分辨率下, 也可以利用细胞内的平均荧光强度来分析细胞膜的荧光强度。据我们所知, 这是第一次使用这种基于多光谱成像的计数技术报告预后结果的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
修改和故障排除:
组织质量是一个重要的参数;它可以很容易地通过苏木精和曙红着色检查。
该技术的一个优点是可能的多路复用染色, 但为了避免荧光溢出, 它建议选择的发射波长的三角洲 10 nm 最小。在这里, 因为我们有4染色包括 DAPI, 我们选择展开波长 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, 菁 3: 570 nm, 菁 5: 670 nm)。通过使用软件计算混合发射信号中的荧光?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家杜邦癌症 (印加) (et)、甲组织癌症 (et)、大学大学巴黎太阳 (et)、Selectimmunco (et)、Labex 免疫肿瘤学 (et)、SIRIC CARPEM (CG 等) 赠款的资助。电子是由一个基金会的研究金弧形。EV 和 CD 由 APHP (交易所 année 研究) 的奖学金资助。慢性乙肝由大学索邦巴黎太阳 (合同博士) 的奖学金资助。作者感谢布里斯托尔迈尔斯宝在这个项目上的资助。作者感谢医院 europ 乔治蓬皮杜和尼克 (Laurianne Chambolle, Elodie 米歇尔和 Gisèle Legall) 的病理学系。作者感谢 PARCC, 医院 europ 乔治蓬皮杜 (科琳 Lesaffre) 的组织学平台。
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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