Multiplexado de análisis de la inmunofluorescencia y la cuantificación de Intratumoral PD-1+ + de Tim-3 CD8 células+ T
Summary
Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.
Abstract
Las células inmunes son importantes componentes del microambiente tumoral e influyen en el crecimiento del tumor y la evolución en todas las etapas de la carcinogénesis. En particular, está ahora bien establecido que el infiltrado inmune en tumores humanos puede correlacionan con el pronóstico y respuesta al tratamiento. El análisis de la infiltración inmunitaria en el microambiente del tumor se ha convertido en un reto importante para la clasificación de los pacientes y la respuesta al tratamiento.
La coexpresión de los receptores inhibitorios como programa celular muerte proteína 1 (PD1; también conocido como CD279), citotóxico linfocitos T asociados proteína 4 (CTLA-4), T-Cell de la inmunoglobulina y mucina que contienen proteína-3 (Tim 3; también conocido como CD366) y linfocitos Activación gen 3 (Lag-3; también conocido como CD223), es un sello de agotamiento de la célula de T. Hemos desarrollado una inmunofluorescencia multiparamétrico en situ tinción para identificar y cuantificar a nivel celular la coexpresión de estos receptores inhibitorios. En una serie retrospectiva de tejido congelado de los carcinomas de células renales (RCC), utilizando una tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia junto con un software de análisis de imagen, se encontró que la expresión de PD-1 y Tim-3 el tumor infiltrante CD8+ T células se correlaciona con un pronóstico pobre en RCC. A nuestro conocimiento, esto representa el primer estudio que demuestra que este automatizado tecnología multiplex in situ puede tener alguna importancia clínica.
Introduction
En los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como un tratamiento prometedor para muchos tipos de cánceres, incluyendo RCC. Particularmente, la inmunoterapia basada en la inhibición de los puestos de control inhibitorios como PD-1 y CTLA-4 se ha divulgado para ser clínicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticuerpos monoclonales contra CTLA-4, PD-1, o programa muerte ligando 1 (PD-L1) están ya aprobados en varios cánceres y conducen a respuestas clínicas duraderas en más del 20% de los pacientes7. Sin embargo, no todos los pacientes son respondedores, el costo del tratamiento es alta, y estos tratamientos son tóxicos, llevando a graves autoinmunes-como efectos secundarios. Por lo tanto, el reto actual es identificar marcadores predictivos para esas nuevas inmunoterapias. La tasa de mutaciones en el tumor, la expresión de PD-L1 o los niveles de intratumoral CD8+ infiltración de células T se han divulgado para correlacionar con la respuesta clínica. Sin embargo, esta asociación sigue siendo demasiado débil para recomendar el uso de estos biomarcadores clínicos en la práctica clínica, salvo la prueba compañero para PD-L1 antes de la administración de Pembrolizumab en células no pequeñas lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Se ha demostrado que la expresión conjunta de muchos receptores inhibitorios como PD-1 Tim 3, Lag-3, y CTLA-4, induce un fenotipo de agotamiento de la célula y la resistencia a la terapia13,14,15. Desde sangre periférica no es representativa del microambiente tumoral, es de gran interés para analizar las características fenotípicas de las células in situ. PD-1 y Tim-3 Co expresando las células de T son conocidas por ser células funcionalmente deterioradas en varios contextos13,16,17. En este estudio, el impacto pronóstico de la coexpresión de los receptores inhibitorios dos PD-1 y Tim-3 en CD8+ T las células fue evaluada.
Hasta ahora, estudiando la coexpresión de marcadores múltiples de tumor (TILs) los linfocitos de la infiltración se ha realizado principalmente por análisis de citometría de flujo, lo que es necesario trabajar en tumores frescos y por lo tanto perjuicio análisis retrospectivos. Convencionales en situ tinción, tinción sólo uno a la vez puede llevar a cabo, y la caracterización del tipo de la célula que expresa conjuntamente los marcadores no es posible. Por ejemplo, PD-L1 es expresada por muchos tipos de células del microambiente tumoral, lo que es difícil de definir por análisis inmunohistoquímica convencionales que las células que expresan PD-L1 son los más relevantes estudios correlativos. En este trabajo, hemos desarrollado un método innovador en situ multiparamétrico inmunofluorescencia con la cuenta de equipo correlacionar la co-expresión de PD-1 y Tim-3 por tumor infiltrante CD8+ las células T con los resultados clínicos en RCC. Esta técnica tiene varias ventajas, incluyendo la posibilidad de analizar a un nivel unicelular y marcadores múltiples al mismo tiempo usando una cámara multiespectral que puede captar intervalos restringidos > 10 nanómetro a través del cristal líquido filtros18. Por otra parte, el procedimiento es automático que permite un análisis acortado comparado con técnicas manuales19y una reproducibilidad inter-operador. En el campo del cáncer, varios estudios informaron convencer los stainings múltiples de moléculas inmunes como PD-1, PD-L1 y CD8 en carcinoma de células de Merkel, cáncer de pulmón y cabeza y cuello cáncer20,21,22, 23. el recuento celular automatizado es posible con capacitación por parte del usuario (paso de fenotipo). La fluorescencia se mide en los compartimientos diferentes de la célula (núcleo, citoplasma y membrana).
Aquí, diversos subconjuntos de la tumor-infiltración CD8+ T células expresando PD-1 y Tim-3 en una cohorte grande de RCC fueron contados y los resultados fueron correlacionados con las puntuaciones de gravedad clínica y parámetros de supervivencia. También es posible analizar la intensidad de fluorescencia de membrana en la resolución de celular con datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) como en la citometría. Lo que sabemos, esto representa el primer estudio informes pronóstico resultados utilizando esta técnica de conteo basado en proyección de imagen multiespectral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificaciones y resolución de problemas:
La calidad del tejido es un parámetro importante; puede comprobarse fácilmente por la coloración de hematoxilina y eosina.
Una de las ventajas de la técnica es la posibilidad de multiplexado stainings, pero para evitar el contagio del fluoróforo, recomienda para seleccionar longitudes de onda de emisión con delta de 10 mínimo de nm. Aquí, porque teníamos 4 stainings incluyendo DAPI, decidimos difun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (INCA) (ET), Ligue contre le cáncer (ET), Cité Université de Paris Sorbonne (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), empresa Labex inmuno-Oncología (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG fue financiado por una beca de la Fundación arco. EV y CD fueron financiados por una beca de php (bolsa année recherche). ChB es financiado por una beca de la Université Sorbonne París Cité (contrat doctoral). Los autores agradecen a Bristol Myers Squibb para su financiación en este proyecto. Los autores agradecen al Departamento de patología del hospital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Gisèle Legall). Los autores agradecen la plataforma histología de PARCC, hospital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
References
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
- Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
- Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
- Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
- Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
- Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
- Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean?. J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
- Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
- Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437 (2017).
- Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, S151-S159 (2016).
- Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
- Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
- Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
- Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
- Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221 (2017).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
- Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10 (2016).
- Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47 (2015).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
- Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120 (2013).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095 (2017).
