Oprichting van een extracellulaire zure pH cultuur systeem
Summary
De zure tumor communicatie speelt belangrijke rol in de progressie van de tumor. Om te beoordelen van de gevolgen van zure extracellulaire pH voor kanker cellen in vitro vastgesteld we eenvoudige zure cultuur systemen.
Abstract
Voorwaarden van de tumor communicatie, zoals hypoxie of nutriënten honger, spelen belangrijke rol in de progressie van kanker en maligniteit. Echter, de rol van zure extracellulaire pH in tumor agressiviteit en het onderliggende mechanisme heeft niet uitvoerig bestudeerd in vergelijking met hypoxische of nutriënten honger voorwaarden. Daarnaast is een welomschreven cultuur methode om na te bootsen de zure extracellulaire tumor communicatie niet volledig gemeld.
Hier presenteren we een eenvoudige in vitro cultuur methode om met behulp van de zure pH van de extracellulaire verminderd bicarbonaat en verhoogde lactaat of HCl concentraties in het kweekmedium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en geleidelijk daalde met 72 h na cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Drie verschillende zure media voorwaarden in deze studie zeer upregulated pH-responsieve genen zoals MSMO1, INSIG1en IDI1 ten opzichte van hypoxie of nutriënten honger. De opregulatie van deze genen kan worden gebruikt als een marker van zure pH. Deze eenvoudige technieken zijn nuttig voor het verhelderen van de onderliggende mechanismen van tumor maligniteit onder zure tumor communicatie. Daarom kunnen onze extracellulaire zure pH cultuur system ontdekking van cellulaire zure pH reacties niet alleen in kankercellen, maar ook in primaire cellen, zoals renale tubulaire cellen, met betrekking tot de andere zure aandoeningen waaronder, diabetische ketoacidose, melkzuur acidose, renale tubulaire acidose en respiratoire acidose.
Introduction
De tumor communicatie speelt een belangrijke rol in de progressie van de tumor en kanker cel stofwisseling1,2,3. Kankercellen zijn vaak blootgesteld aan voorwaarden zoals hypoxie, nutriënten ontbering en zure extracellulaire pH (pHe). Echter, de rol van pHe in tumor progressie is niet opgehelderd zo uitgebreid zoals hypoxie of nutriënt honger. De pHe in de tumor weefsel kan worden zuur, ongeveer pH 6.84,5te bereiken. De zure pH vloeit voort uit de aërobe en anaërobe glycolytic uitscheiding van protonen (H+) en lactaat door delende kanker cellen5,6.
Recente studies is gebleken dat zure pHe-geïnduceerde Histon exocytose van zure lysosomen voor aanpassing aan de ernstige zure omgeving7,8,9,10, deacetylation en oxidatie van de vetzuren. Nochtans, de mechanismen via welke extracellulaire verzuring is van invloed op kanker gedrag en de identiteit van de sleutel regelgevers in de zure pH tumor communicatie zijn nog niet volledig vastgesteld. Bovendien verschillende rapporten beschreven verschillende zure pH media met behulp van onduidelijk concentraties van bicarbonaat, Tris, PIJPEN en HEPES-buffer of lactaat en HCl, maar er zijn weinig rapporten om aan te tonen van de stabiliteit van de gecorrigeerde middellange noch uitgebreide vergelijking van verschillende afzonderlijke zure voedingsbodems7,8,9,10
Om te verhelderen de belangrijkste regelgevers en metabole veranderingen in kankercellen in het kader van extracellulaire verzuring, we een eenvoudige in vitro cultuur model voor het handhaven van een zure pHe opgericht en gebogen over de rol van pHe in kanker cellen11. Met behulp van deze methode, wij onderhouden een zure kweekmedium met een pHe van 6,8 bij 37 ° C minder dan 5% CO2, met behulp van verminderde bicarbonaat concentraties in het kweekmedium. pH 7.4 werd gebruikt als normaal en controle van medium. De middellange pH was opgelopen gedurende ten minste 24 uur en daalde geleidelijk met 72 h tijdens cultuur van PANC-1 en AsPC-1 pancreatic kankercellen. Omdat u verbeterde glycolyse versnelt uitscheiding van niet alleen de protonen, maar ook de lactaat7,8,9, wij vastgesteld een cultuur methode lactaat-geïnduceerde acidose nabootsen door toevoegen van lactaat in plaats van het verminderen van de bicarbonaat concentratie. Bovendien, HCl-geïnduceerde zure pHe in het medium stelt ons in staat om uit te sluiten van de mogelijkheid die cellulaire reacties op zure pH kweekmedium niet als gevolg van een verminderde concentratie van bicarbonaat. Bovendien, voor informatie over het gebruik van verschillende media met een pH van 6.4 tot en met 7.4 met concentratie van de verschillende bicarbonaat we kunnen beoordelen in welke mate van pHe gevolgen voor cellulaire reacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschreven hier, een eenvoudige zure pH cultuur systeem en het evaluatieproces. De combinatie van drie methoden voor middelgrote verzuring, dat wil zeggen, verminderde bicarbonaat concentratie, lactaat toevoeging en HCl toevoeging, konden we het pH-response-mechanisme grondig onderzoeken en vergelijken van de cellulaire reactie op andere tumor microenvironmental voorwaarden zoals hypoxie of nutriënt honger.
De sleutel van deze methode is het bepalen van de juiste concentraties van…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de afdeling of genoom Science en laboratorium voor systeembiologie en geneeskunde, RCAST, de Universiteit van Tokio. Wij bedanken met name Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida, en Dr. A.
Kunisato (Mizuho Securities Kirin Co., Ltd.) voor nuttige discussies en steun. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Grant-in-Aid voor jonge wetenschapper (A) (26710005), to, Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (26116711 en 16 H 01567, to), en Grant-in-Aid voor uitdagend
Verkennend onderzoek (16K 14605, to) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan, de Takeda Science Foundation (to), de Stichting Kobayashi van kankeronderzoek (to) en het Project voor kankeronderzoek en Therapeutische Evolution (P-maken) en de praktische onderzoek voor innovatieve kankerbestrijding van Japan Agentschap voor medisch onderzoek en ontwikkeling, AMED (to).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
- Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
- Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
- Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
- McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
- Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752 (2015).
- Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).
- Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).
