Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem
Summary
Die sauren Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rollen in Tumorprogression. Um die Auswirkungen des sauren extrazellulären pH auf Krebs Zellen in vitro zu beurteilen haben wir einfache saure Kultur-Systeme etabliert.
Abstract
Bedingungen der Tumor Mikroumgebung, z. B. Hypoxie oder Nährstoff Hunger, spielen wichtige Rollen in der Tumorprogression und Bösartigkeit. Jedoch wurde die Rolle der sauren extrazellulären pH im Tumor Aggressivität und der zugrunde liegende Mechanismus nicht ausgiebig gegenüber Hypoxie oder Nährstoff verhungern Bedingungen untersucht. Darüber hinaus wurde eine klar definierte Kultur-Methode, um die sauren extrazelluläre Tumor Mikroumgebung imitieren nicht vollständig gemeldet.
Hier präsentieren wir eine einfache in-vitro- Kultur Methode, um beizubehalten, sauren extrazellulären pH mit Bikarbonat und erhöhte Laktat oder HCl-Konzentrationen in das Kulturmedium verringert. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h nach Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Drei unterschiedliche sauren Medien Bedingungen in dieser Studie im Vergleich hoch hochreguliert pH-responsive Gene wie MSMO1, INSIG1und IDI1 zu Hypoxie oder Nährstoff Hunger. Die Hochregulation dieser Gene kann als Marker des sauren pH-Wertes verwendet werden. Diese einfachen Techniken sind vorteilhaft für die zugrunde liegenden Mechanismen der malignen Tumor unter sauren Tumor Mikroumgebung aufzuklären. Unser extrazelluläre sauren pH-Wert-Kultur-System ermöglicht somit, Entdeckung der zellulären sauren pH-Wert Antworten nicht nur in den Krebszellen, sondern auch in Primärzellen, z. B. röhrenförmigen Nierenzellen, in Bezug auf die anderen sauren Störungen einschließlich, diabetische Ketoazidose, Laktatazidose, renale tubuläre Azidose und Respiratorische Azidose.
Introduction
Der Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rolle in der Tumorprogression und Krebs Zelle Stoffwechsel1,2,3. Krebszellen sind oft an Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoff Entbehrungen und sauren extrazellulären pH (pHe) ausgesetzt. Jedoch die Rolle der PWT in Tumorprogression nicht geklärt so umfassend wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern. PHe im Tumorgewebe werden sauer, etwa pH 6,84,5zu erreichen. Die saure pH-Wert ergibt sich aus aeroben und anaeroben glykolytischen Ausscheidung von Protonen (H+) und Laktat durch wuchernden Krebs Zellen5,6.
Neuere Studien gezeigt, dass sauer pHe-induzierte Histon Deacetylation, Fettsäureoxidation und Exozytose von sauren Lysosomen zur Anpassung an die starken sauren Milieu7,8,9,10. Die Mechanismen, durch welche extrazelluläre Übersäuerung beeinträchtigt jedoch Krebs Verhalten und die Identität des Schlüssels, die Regulierungsbehörden in den sauren pH-Wert Tumor Mikroumgebung nicht vollständig ermittelt wurden. Darüber hinaus mehrere Berichte beschrieben verschiedene sauren pH-Wert-Medien mit unklaren Konzentrationen von Bikarbonat, Tris, Rohre und HEPES-Puffer oder Laktat und HCl, aber es gibt einige Berichte, die Stabilität der die angepasste mittlere noch umfassender zu demonstrieren Vergleich von mehrere verschiedene saure Nährmedien7,8,9,10
Um die wichtigsten Regulatoren und metabolischen Veränderungen in Krebszellen im Rahmen der extrazelluläre Übersäuerung zu erhellen, wir eine einfache in-vitro- Kultur-Modell zur Aufrechterhaltung eines sauren pHe und untersuchte die Rolle von pHe in Krebs Zellen11. Mit dieser Methode, wir erhalten eine saure Kulturmedium mit einem PWT von 6,8 bei 37 ° C weniger als 5 % CO2, mit reduzierten Bicarbonat Konzentrationen in das Kulturmedium. pH 7.4 diente als normal und Medium zu kontrollieren. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h während der Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Da erhöhte Glykolyse beschleunigt die Ausscheidung von Protonen sondern auch Laktat7,8,9, wir auch etabliert eine Kultur-Methode imitiert Laktat-induzierten Azidose durch Hinzufügen von Laktat, anstatt verringern die Bikarbonatkonzentration. HCl-induzierte sauren pHe im Medium ermöglicht darüber hinaus ausschließen, die zelluläre Reaktionen auf sauren pH-Wert Kulturmedium nicht durch eine verminderte Konzentration von Bikarbonat. Mit verschiedenen Medien mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,4 mit verschiedenen Bikarbonatkonzentration, können wir darüber hinaus das Ausmaß der PWT Auswirkungen auf zellulärer Antworten bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir hier eine einfache sauren pH-Wert Kultursystem und seine Bewertung. Die Kombination der drei Methoden der mittleren Versauerung, d.h.reduzierte Bikarbonatkonzentration, Laktat-Zusatz und HCl hinaus ermöglichte, die pH-Wirkungs-Mechanismus gründlich zu untersuchen und die zelluläre Antwort auf andere Tumor vergleichen microenvironmental Erkrankungen wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern.
Der Schlüssel dieser Methode ist, die entsprechenden Konzentrationen von Bikarbonat, Lakta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Mitgliedern des Division of Genome Science and Laboratory für Systembiologie und Medizin, RCAST, The University of Tokyo. Wir danken vor allem Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSMB, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida und Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) für hilfreiche Gespräche und Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (A) (26710005, T.O.), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (26116711 und 16 H 01567, T.O.) und Beihilfe für anspruchsvolle
Explorative Forschung (16K 14605, T.O.) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan, der Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi Stiftung Krebsforschung (T.O.) und das Projekt für die Krebsforschung und Therapeutischen Evolution (P-erstellen) und die praktische Forschung für Innovative Krebsbekämpfung aus Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED (T.O.).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
| 0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
| 0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
| Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
| Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
| KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
| TIG | JCRB Cell Bank | ||
| MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
| HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |
References
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