التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية
Summary
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وداخل الخلايا. وهنا أصف على بروتوكول في فيفو تسجيل وتحليل للنقل محواري وإينترافلاجيلار في C. ايليجانس.
Abstract
محواري النقل والنقل إينترافلاجيلار (ايفت) ضرورية ل morphogenesis إكسون واهداب والدالة. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين من المحركات الجزيئية التي تنظم أنتيروجرادي والنقل إلى الوراء، على التوالي. هذه المحركات تستخدم شبكات microtubule كالقضبان. ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) كائن نموذج قوية لدراسة النقل محواري وايفت في فيفو. هنا، أود أن أصف بروتوكول لمراقبة النقل محواري وايفت في المعيشة C. ايليجانس. يمكن تصور البضائع المشحونة بعلامات البضائع البروتينات باستخدام البروتينات الفلورية مثل البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل). C. ايليجانس يتسم بالشفافية ويمكن التعبير عن البروتينات البضائع معلم بروتينات فلورية خضراء في خلايا معينة تحت المروجين خلية على حدة. يمكن أن تكون ثابتة الديدان الحية التي ميكروبيدس على 10% [اغروس] هلام دون قتل أو أنيسثيتيزينج الديدان. في ظل هذه الظروف، حركة نقل البضائع مباشرة يلاحظ في محاور عصبية واهداب المعيشة C. ايليجانس دون تشريح. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة أي جزيء البضائع في أي من الخلايا عن طريق تعديل بروتينات المستهدفة و/أو الخلايا يتم التعبير عنها في. هي المصانة البروتينات الأساسية مثل المحركات الجزيئية ومحول البروتينات التي تشارك في نقل محواري وايفت في C. ايليجانس. بالمقارنة مع غيرها من الكائنات نموذج، يمكن الحصول على طفرات وصيانتها بسهولة أكبر في C. ايليجانس. يمكن دمج هذا الأسلوب مع مختلف C. ايليجانس طفرات لتوضيح الآليات الجزيئية للنقل محواري وايفت.
Introduction
تصوير الخلية الحية أداة أساسية لتحليل النقل داخل الخلايا. في بيولوجيا الخلايا العصبية، تحليلات للنقل محواري مع تصوير الخلية الحية ضرورية لفهم العصبية الدالة و morphogenesis1. عيوب في النقل محواري تكمن وراء عدة اضطرابات الأعصاب2. Kinesin فوق عائلة البروتينات ودينين القيام بالنقل محواري أنتيروجراديلي وريتروجراديلي، على التوالي1،2.
أهداب هي آخر حجرة الخلوية التي هي الشبكة ميكروتوبولي وآلية الاتجار المتقدمة جداً3. يتم ترجمة البروتين التوليف إليه لا بأهداب، مما يعني أنه يتعين نقل البروتينات الهدبية من السيتوبلازم إلى نصائح أهداب. Kinesin الخاصة بأهداب ودينين، يسمى kinesin-2 وهيولى دينين-2، على التوالي، ونقل مكونات أهداب4، في ظاهرة تسمى النقل إينترافلاجيلار (ايفت)5. أسباب إعاقة IFT طائفة أمراض تسمى سيليوباثيس6. وهكذا، مطلوب تحليل إليه ايفت بتصوير الخلايا الحية لفهم الآليات الأساسية لتشكيل الهدبية والمرضية.
ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) نموذج جيد لدراسة النقل محواري وايفت7،،من89. لمراقبة ايفت، Chlamydomonas قد استخدمت على نطاق واسع كنموذج كائن5،6. كما تشلاميدوموناس كائن أحادي الخلية، سيكون من الصعب لتحليل علاقة ايفت بالشيخوخة ووظيفة الخلايا العصبية والسلوك. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت لا التقنيات الوراثية الأساسية مثل كريسبر/Cas9 إلى تشلاميدوموناس. في أعلى نموذج الكائنات، مثل الفئران و المورفولوجية، يسبب تعطل النقل محواري و IFT وكثيراً ما تعمل قاتلة لأن النقل محواري و IFT ضرورية ل morphogenesis والتوازن من الحيوانات 10، 11. في حالة الفئران، خلية ثقافة وتعداء عموما مطلوب لمراقبة النقل محواري وإيفت، الأمر الذي يتطلب الكثير من المهارات والوقت واسعة12،13. وبالإضافة إلى ذلك، قد فقدت الكثير من سياق الفسيولوجية الهامة في الخلايا المستزرعة وخطوط الخلية. للجهاز العصبي ليست ضرورية للبقاء على قيد الحياة الديدان، تعطلت C. ايليجانس طفرات في النقل محواري أو إيفت التي غالباً ما تكون غير قاتلة7،،من914. النقل محواري وايفت يمكن مباشرة ملاحظة في فيفو دون تشريح لأن C. ايليجانس شفافة وذلك من السهل ملاحظة علامات معلم بروتينات فلورية خضراء.
وهناك العديد من البروتوكولات شل C. ايليجانس، مثل استخدام جهاز موائع جزيئية15ومنصات [اغروس] مع التخدير16أو17من ميكروبيدس. إدراج التخدير قد تمنع الاتجار الأحداث في الخلايا العصبية15. عيب واضح من الأسلوب موائع جزيئية-الجهاز أن إعداد جهاز موائع جزيئية ليس دائماً أمرا سهلاً. بدلاً من ذلك، يتم التثبيت قبل ميكروبيدس ومنصات [اغروس] طريقة مريحة وسهلة لإجراء تصوير مرور الزمن في C. ايليجانس. وهنا أصف هذا البروتوكول الأساسية شل C. ايليجانس ووضع تصور للنقل محواري وايفت في فيفو في C. ايليجانس. مقارنة بالأساليب الأخرى، الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب معدات خاصة، وهو أرخص بكثير وأسهل لتنفيذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقادم فيما يتعلق بالأساليب القائمة
الأسلوب الموصوفة هنا هو الأمثل لمراقبة الأحداث سريعة مثل النقل محواري وايفت. وهكذا، الأولوية لتجميد أكثر من حضانة أطول. بينما تمكنا من مراقبة الاتجار الأحداث لمدة 20 دقيقة على الأقل دون اضطراب كبير، هذا الأسلوب قد لا تكون دائماً مناسبة لمرا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
عميق شكرا مقدم البلاغ الدكتور أساكو Sugimoto (جامعة توهوكو) لمناقشة مفيدة لها. وكان wyIs251 هدية سخية من الدكتورة كانغ شين (جامعة ستانفورد). قدم mnIs17 كجك، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة “برامج الهياكل الأساسية للبحوث” (P40 OD010440). أيد هذا العمل دايتشي سانكيو مؤسسة، مؤسسة علوم المخ ومؤسسة نايتو ومنحة كاكينهي JSPS #17 ح 05010 و #16 ح 06536.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell’s antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell’s antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
