Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen
Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.
Abstract
Axonale vervoer en intraflagellair (IFT) zijn essentieel voor de axon en cilia genuitdrukking en functie. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein zijn moleculaire motoren die anterograde en retrograde vervoer, respectievelijk regelen. Deze motoren gebruiken microtubulus netwerken als rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme axonale vervoer en IFT in vivote studeren. Hier beschrijf ik een protocol om te observeren axonale vervoer en IFT in levende C. elegans. Vervoerde lading kan worden gevisualiseerd door tagging lading eiwitten met behulp van fluorescente proteïnen zoals groen fluorescente proteïne (GFP). C. elegans is transparant en lading GFP-gelabelde proteïnen kunnen worden uitgedrukt in specifieke cellen onder cel-specifieke initiatiefnemers. Levende wormen kunnen worden opgelost door microbeads op 10% agarose gel zonder doden of anesthetizing van de wormen. Onder deze omstandigheden, vracht verkeer kan direct worden waargenomen in de axonen en cilia van levende C. elegans zonder dissectie. Deze methode kan worden toegepast op de waarneming van elke lading molecule in cellen door aanpassing van de doel-eiwitten en/of de cellen die ze zijn uitgedrukt in. Meest elementaire eiwitten zoals moleculaire motoren en adaptor eiwitten die bij axonale vervoer en IFT betrokken zijn zijn bewaard in C. elegans. Vergeleken met andere modelorganismen, zijn mutanten verkregen en gemakkelijker te onderhouden in C. elegans. Deze methode te combineren met verschillende C. elegans mutanten kan verduidelijken de moleculaire mechanismen van axonale vervoer en IFT.
Introduction
Levende cel imaging is een essentieel instrument voor het analyseren van intracellulair transport. In de neuronale celbiologie zijn analyses van axonale vervoer met levende cel beeldvorming essentieel voor een goed begrip van de neuronale functie en morfogenese1. Defecten in axonale vervoer ten grondslag liggen aan diverse neurodegeneratieve aandoeningen2. Kinesin superfamilie eiwitten en dynein dragen uit axonale vervoer anterogradely en retrogradely, respectievelijk1,2.
Cilia zijn een andere cellulaire compartiment waarin de microtubulus netwerk en mensenhandel machines hoogontwikkelde3 zijn. Eiwit synthese machines is niet vertaald in cilia, wat betekent dat Ciliaire eiwitten van het cytoplasma naar de cilia tips moeten worden vervoerd. Cilia-specifieke kinesin en dynein, kinesin-2 en cytoplasmatische dynein-2, respectievelijk genoemd, [LbMarket_Transport] de componenten van de cilia4, een verschijnsel genaamd intraflagellair vervoer (IFT)5. Bijzondere waardevermindering van IFT veroorzaakt een spectrum van ziekten genaamd ciliopathies6. Analyse van het mechanisme van de IFT door levende cel imaging is dus vereist om te begrijpen van de basismechanismen van Ciliaire vorming en pathogenese.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model axonale vervoer en IFT7,8,9te gaan studeren. Om te observeren IFT, is Chlamydomonas wijd verbeid gebruikt als een model organisme5,6. Zoals Chlamydomonas een eencellige organisme is, zou de relatie van IFT met veroudering, neuronale functie, en gedrag moeilijk te analyseren zijn. Essentiële genetische technieken zoals CRISPR/Cas9 zijn bovendien niet toegepast op Chlamydomonas. In hogere modelorganismen, zoals muizen en Drosophila, veroorzaakt verstoring van axonale vervoer en IFT vaak dodelijke fenotypen omdat axonale vervoer en IFT essentieel voor de voedselproductie en de homeostase van de dieren 10zijn, 11. In het geval van muizen, is celkweek en transfectie over het algemeen nodig om te observeren axonale vervoer en IFT, waarvoor veel vaardigheden en uitgebreide tijd12,13. Daarnaast kan een heleboel belangrijke fysiologische context in gekweekte cellen en cellijnen worden verloren. Omdat het zenuwstelsel niet essentieel voor het voortbestaan van de wormen is, C. elegans mutanten in welke axonale vervoer of IFT worden verstoord zijn vaak niet dodelijk7,9,14. Axonale vervoer en IFT direct waarneembaar in vivo zonder dissectie omdat C. elegans is het transparante en het is daarom gemakkelijk te observeren GFP-gelabeld markeringen.
Er zijn verschillende protocollen te immobiliseren C. elegans, zoals het gebruik van een microfluidic apparaat15, agarose pads met verdoving16of microbeads17. De opneming van de verdoving kan de mensenhandel gebeurtenissen in neuronen15remmen. Een duidelijk nadeel van de methode van de microfluidic-apparaat is dat voorbereiding van een microfluidic-apparaat niet altijd gemakkelijk is. In plaats daarvan, immobilisatie door agarose pads en microbeads is een handige en gemakkelijke manier om uit te voeren tijd vervallen imaging in C. elegans. Hier beschrijf ik dit basisprotocol te immobiliseren C. elegans en visualiseren van axonale vervoer en IFT in vivo de C. elegans. In vergelijking met de andere methoden, de hier beschreven methode vereist geen speciale apparatuur en is veel goedkoper en eenvoudiger uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beperking met betrekking tot bestaande methoden
De hier beschreven methode is geoptimaliseerd om te zien hoe snel evenementen zoals axonale vervoer en IFT. Immobilisatie is dus meer prioriteit dan langer incubatie. Terwijl wij kunnen observeren van mensenhandel gebeurtenissen voor ten minste 20 min. zonder aanzienlijke verstoring hebben, deze methode mogelijk niet altijd geschikt voor het observeren van langzame gebeurtenissen waarvoor langere opmerkingen, zoals axon rek en cel migratie. Voor langere …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur dankt diep Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) voor haar nuttige discussie. wyIs251 was een gulle gift van Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 werd verstrekt door de CGC, die wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 en #16 H 06536 en Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation en Naito Foundation.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell’s antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell’s antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
