Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Published: October 18, 2017

doi:

¹Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences,Tohoku University

Summary

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Abstract

Axonalen Transport und intraflagellar Transport (IFT) sind wesentlich für Axon und Zilien Morphogenese und Funktion. Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien sind molekulare Motoren, die Anterograde und retrograder Transport bzw. regulieren. Diese Motoren verwenden Mikrotubuli Netzwerke als Schienen. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine leistungsstarke Modellorganismus axonalen Transport und IFT in Vivozu studieren. Ich beschreibe hier ein Protokoll zur axonalen Transport und IFT in lebenden beobachten C. Elegans. Beförderten Güter kann durch die Kennzeichnung Ladung Proteine mit fluoreszierenden Proteinen wie grün fluoreszierendes Protein (GFP) visualisiert werden. C. Elegans ist transparent und GFP-Tags Ladung Proteine in bestimmten Zellen unter zellspezifische Promotoren ausgedrückt werden können. Lebende Würmer können durch Microbeads auf 10 % Agarose-Gel fixiert werden, ohne zu töten oder betäuben die Würmer. Unter diesen Bedingungen kann Fracht Bewegung direkt in die Axone und Zilien des Lebens beobachtet werden C. Elegans ohne Dissektion. Diese Methode kann angewendet werden, um die Beobachtung Fracht-Moleküls in alle Zellen durch Ändern der Zielproteine und/oder die Zellen, die, denen Sie in ausgedrückt werden. Grundlegendsten wie molekulare Motoren und Adapter-Proteine, die axonalen Transport und IFT beteiligt sind sind in C. Eleganskonserviert. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen, werden Mutanten erhalten und leichter in C. Elegansgepflegt. Kombination dieser Methode mit verschiedenen C. Elegans Mutanten kann die molekularen Mechanismen der axonalen Transport und IFT klären.

Introduction

Live Cell Imaging ist ein wesentliches Instrument für die Analyse von intrazellulären Transport. In neuronale Zellbiologie sind Analysen des axonalen Transports mit live Cell Imaging unerlässlich für das Verständnis der neuronalen Funktion und Morphogenese¹. Mängel im axonalen Transport unterliegen verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen². Kinesin-Superfamilie Proteine und Dynien durchführen bzw. axonalen Transport Anterogradely und Doppelthebel,¹^,².

Zilien sind ein weiteres zellulären Fach, in dem die Mikrotubuli Netzwerk und Menschenhandel Maschinen hochentwickelte³sind. Protein Synthese Maschinen ist nicht in Zilien, lokalisiert, d.h. ciliary Proteine zu den Zilien-Tipps aus dem Zytoplasma transportiert werden müssen. Zilien-spezifische Kinesin und Dynien, namens Kinesin-2 und zytoplasmatischen Dynien-2, bzw., transport der Komponenten der Zilien⁴, in ein Phänomen namens intraflagellar Transport (IFT)⁵. Beeinträchtigung der IFT verursacht ein Spektrum von Krankheiten genannt Ciliopathies⁶. Somit ist Analyse der IFT-Mechanismus von live Cell Imaging erforderlich grundlegende Mechanismen der ciliary Entstehung und Pathogenese zu verstehen.

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen Transport und IFT⁷^,⁸^,⁹zu studieren. Um IFT zu beobachten, hat Chlamydomonas als Modell Organismus⁵^,⁶verbreitet. Wie Chlamydomonas eines einzelligen Organismus ist, wäre das Verhältnis von IFT mit Altern, neuronale Funktion und Verhalten schwer zu analysieren. Darüber hinaus wurden wichtige genetische Techniken wie CRISPR/Cas9 nicht auf Chlamydomonasangewendet. Bei höheren Modellorganismen wie Mäuse und Drosophilaverursacht Störung des axonalen Transports und IFT oft tödliche Phänotypen, weil axonalen Transport und IFT für die Morphogenese und Homöostase der Tiere ¹⁰^{notwendig sind,} ¹¹. Bei Mäusen ist Zellkultur und Transfektion in der Regel zu beobachten axonalen Transport und IFT, wonach viele Fähigkeiten und umfangreiche Zeit¹²^,¹³erforderlich. Darüber hinaus kann viele wichtige physiologische Zusammenhänge in kultivierten Zellen und Zell-Linien verloren gehen. C. Elegans Mutanten in denen axonalen Transport oder IFT werden gestört, weil das Nervensystem nicht essentiell für das Überleben der Würmer ist, sind oft nicht tödliche⁷^,⁹^,¹⁴. Axonalen Transport und IFT können direkt in Vivo ohne Dissektion beobachtet werden, weil C. Elegans transparent ist und deshalb einfach zu GFP-Tags Marker zu beobachten.

Es gibt mehrere Protokolle, C. Elegans, z. B. die Verwendung eines mikrofluidischen Gerät¹⁵, Agarose-Pads mit Anästhesie¹⁶oder Microbeads¹⁷zu immobilisieren. Die Einbeziehung der Narkose kann der Menschenhandel Ereignisse in Neuronen¹⁵hemmen. Ein klarer Nachteil der Mikrofluidik-Gerät Methode ist, dass die Vorbereitung einer mikrofluidischen Gerät nicht immer einfach ist. Immobilisierung von Agarose-Pads und Microbeads ist stattdessen eine bequeme und einfache Möglichkeit, Time Lapse Bildgebung in C. Elegansdurchzuführen. Ich beschreibe hier dieses grundlegende Protokoll zu immobilisieren C. Elegans und visualisieren axonalen Transport und IFT in Vivo de C. Elegans. Im Vergleich zu anderen Methoden, die hier beschriebene Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist viel billiger und leichter durchzuführen.

Protocol

1. Probenvorbereitung erzeugen eine transgene C. Elegans Belastung mit transgenen Methoden 18. Alternativ erhalten Sie geeignete Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC). Um axonalen Transport von synaptischen Vesikel Vorstufen zu visualisieren, verwenden die transgene Linie wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT, transgene Linie mnIs17 [Osm-6::gfp] 19 erhalten zu beobachten. Di…

Representative Results

Axonalen Transport in DA9 neuronMit der wyIs251 Linie, die Anterograde und retrograde axonale Transport von GFP::RAB-3 kann in den DA9 Motoneuron gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Anterograde und retrograde Transport in den proximalen dorsalen Axon des Neurons DA9 ist etwa 1,8 und 2,6 µm/s, jeweils22. Die Anzahl der beweglichen Vesikel geht um 0,03 und 0,018 pro μm Axon pro s. So findet man für …

Discussion

Einschränkung in Bezug auf vorhandene Methoden
Die hier beschriebene Methode ist optimiert, um schnell Ereignisse wie axonalen Transport und IFT beobachten. Immobilisierung ist somit mehr als längere Inkubationszeit priorisiert. Während wir Menschenhandel Ereignisse für mindestens 20 Minuten ohne bedeutende Störung beobachtet wurden, kann diese Methode nicht immer zu langsam Ereignisse erfordern längere Beobachtungen, wie Axon Dehnung und Zellwanderung beobachten geeignet. Für längere Beobacht…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Der Autor dankt tief Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) für ihre hilfreiche Diskussion. wyIs251 war ein großzügiges Geschenk von Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 lieferte die CGC, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant #17 H 05010 und #16 H 06536 und Daiichi Sankyo-Stiftung, Brain Science Foundation und Naito Foundation unterstützt.

Materials

Slideglass (76 x 26 mm)	Matsunami	S1111
Coverglass (22 x 40 mm)	Matsunami	C024401
Agarose	Wako	318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micron	Polysciences	#00876
Heat block	TAITEC	0063288-000	CTU-mini
Microscope	Olympus	IX-71	widefield microscope
Spinning disk Scanner	Yokogawa	CSU-X1	spinning disc confocal scanner
Digital CCD camera	Hamamatsu Photonics	C10600-10B	ORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4)	Olympus	UPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch)	IWAKI	IK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)	IWAKI	9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251	Laboratory of Kang Shen	N/A
OTL11: mnIs17	Ref. 27, 29	N/A	SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscope	Carl Zeiss	435064-9000-000	STEMI 508
Mirror transillumination unit	Carl Zeiss	435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm)	Nilaco Corporation	m78483501
60 mm plastic dish	Falcon	#351007
Fiji	N/A	N/A	https://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)			1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4

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Citer Cet Article

Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons. J. Vis. Exp. (128), e56690, doi:10.3791/56690 (2017).