Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller
Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god modell å studere axonal og intracellulær. Her beskrive jeg en protokoll for in vivo -opptak og analyse av axonal og intraflagellar transport i C. elegans.
Abstract
Axonal transport og intraflagellar transport (IFT) er avgjørende for axon og flimmerhårene morphogenesis og funksjon. Kinesin overfamilie proteiner og dynein er molekylære motorer som regulerer anterograd og retrograd transport, henholdsvis. Disse motorene bruker microtubule nettverk som skinner. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en effektiv modell organisme axonal transport og IFT i vivo. Her jeg beskrive en protokoll for å observere axonal transport og IFT i levende C. elegans. Transportert Last kan visualiseres ved å merke Last proteiner bruke fluorescerende proteiner som grønne fluorescerende protein (GFP). C. elegans er gjennomsiktig og GFP-merket Last proteiner kan uttrykkes i bestemte celler under cellen-spesifikke arrangører. Levende ormer kan fikses ved microbeads på 10% agarose gel uten å drepe eller anesthetizing ormer. Under disse forholdene, Last bevegelse direkte observert i axons og flimmerhårene levende C. elegans uten disseksjon. Denne metoden kan brukes til observasjon av noen Last molekyl i celler ved å endre målet proteiner og/eller cellene de uttrykkes i. Mest grunnleggende proteiner som molekylær motorer og adapter proteiner som er involvert i axonal transport og IFT er bevart i C. elegans. Sammenlignet med andre modellen organismer, kan mutanter oppnådd og opprettholdt lettere i C. elegans. Kombinere denne metoden med ulike C. elegans mutanter kan avklare molekylære mekanismer axonal transport og IFT.
Introduction
Levende celle bildebehandling er et viktig verktøy for å analysere intracellulær transport. I neuronal cell biology er analyser av axonal transport med levende celle imaging avgjørende for å forstå neuronal funksjon og morphogenesis1. Feil i axonal transport ligger flere nevrodegenerative lidelser2. Kinesin overfamilie proteiner og dynein bære axonal transport anterogradely og retrogradely, henholdsvis1,2.
Cilia er en annen mobilnettet avlukke der microtubule nettverks- og menneskehandel maskiner er høyt utviklet3. Protein syntese maskiner er ikke lokalisert i flimmerhårene, som betyr at ciliary proteiner må transporteres fra cytoplasma til flimmerhårene tips. Flimmerhårene-spesifikke kinesin og dynein, kalt kinesin-2 og cytoplasmatiske dynein-2, henholdsvis, transport komponentene i flimmerhårene4, i et fenomen som kalles intraflagellar transport (IFT)5. Nedskrivning av IFT fører et spektrum av sykdommer kalt ciliopathies6. Dermed er analyse av IFT mekanismen av levende celle tenkelig nødvendig å forstå grunnleggende mekanismer av ciliary formasjon og patogenesen.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en god modell axonal transport og IFT7,8,9. For å observere IFT, har Chlamydomonas vært mye brukt som en modell organisme5,6. Chlamydomonas er en encellet organisme, ville forholdet mellom IFT med aldring, neuronal funksjon og oppførsel være vanskelig å analysere. I tillegg er viktig genetisk teknikker som CRISPR/Cas9 ikke brukt på Chlamydomonas. I høyere modell organismer, som mus og Drosophila, forårsaker forstyrrelse av axonal transport og IFT ofte dødelig fenotyper fordi axonal transport og IFT er avgjørende for morphogenesis og homeostase av dyr 10, 11. Når det gjelder mus, er cellekultur og hva vanligvis nødvendig å observere axonal transport og IFT, som krever mange ferdigheter og omfattende tid12,13. I tillegg kan en rekke viktige fysiologiske sammenheng gå tapt i kulturperler celler og linjer. Fordi nervesystemet ikke er avgjørende for overlevelsen av ormer, C. elegans mutanter der axonal transport og IFT avbrutt er ofte ikke dødelige7,9,14. Axonal transport og IFT kan være direkte observert i vivo uten disseksjon fordi C. elegans er gjennomsiktig, og det er derfor lett å observere GFP-merket markører.
Det er flere protokoller til nakkens C. elegans, som med en microfluidic enhet15, agarose pads med anestesi16eller microbeads17. Inkludering av anestesi kan hemme menneskehandel hendelsene i neurons15. En klar ulempe av metoden microfluidic-enhet er at forberede en microfluidic enhet ikke er alltid lett. I stedet er immobilisering av agarose pads og microbeads en praktisk og enkel måte å utføre tid forfalle bildebehandling i C. elegans. Her jeg beskrive denne grunnleggende protokollen nakkens C. elegans og visualisere axonal transport IFT og i vivo C. elegans. Sammenlignet med de andre metodene, metoden beskrevet her krever ikke spesialutstyr og er mye billigere og enklere å utføre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begrensninger med hensyn til eksisterende metoder
Metoden beskrevet her er optimalisert for å observere raske hendelser som axonal transport og IFT. Dermed er immobilisering mer prioritert enn lenger inkubasjon. Mens vi har kunnet observere menneskehandel hendelser for minst 20 min uten betydelige forstyrrelsene, kanskje denne metoden passer ikke alltid å observere langsom hendelser som krever lengre observasjoner, som axon forlengelse og celle migrasjon. For lengre observasjoner, man trenger å opt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren Takk dypt Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) for hennes nyttig diskusjon. wyIs251 var en sjenerøs gave fra Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 ble gitt av CGC, som finansieres av NIH Office forskning infrastruktur programmer (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 og #16 H 06536 og Daiichi Sankyo foundation, hjernen vitenskap Foundation og Naito Foundation.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell’s antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell’s antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
