Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller
Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en bra modell att studera axonal och intracellulär transport. Här beskriver jag ett protokoll för in vivo inspelning och analys av axonal och intraflagellar transport i C. elegans.
Abstract
Axonal transport och intraflagellar transport (IFT) är avgörande för axon och flimmerhåren morfogenes och funktion. Kinesin superfamiljen proteiner och dynein är molekylära motorer som reglerar anterograd och retrograd transport, respektive. Dessa motorer använder mikrotubulära nätverk som skenor. Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en kraftfull modellorganism att studera axonal transport och IFT i vivo. Här beskriver jag ett protokoll för att observera axonal transport och IFT i levande C. elegans. Transporterade gods kan visualiseras genom att tagga Last proteiner med hjälp av fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP). C. elegans är transparent och GFP-märkta Last proteiner kan uttryckas i specifika celler under-specifika initiativtagare. Levande maskar kan fastställas av mikrokulor på 10% agarosgel utan att döda eller anesthetizing maskar. Under dessa förhållanden, Last rörelse direkt kan observeras i axoner och flimmerhåren levande C. elegans utan dissektion. Denna metod kan tillämpas till observation av någon last molekylen i alla celler genom att ändra målproteiner eller de celler som de uttrycks i. Mest grundläggande proteiner som molekylära motorer och adapter proteiner som är involverade i axonal transport och IFT bevaras i C. elegans. Jämfört med andra modellorganismer, kan mutanter erhållits och underhålls lättare i C. elegans. Kombinera denna metod med olika C. elegans mutanter kan klargöra molekylära mekanismer för axonal transport och IFT.
Introduction
Levande cellen bildbehandling är ett viktigt verktyg för att analysera intracellulära transport. I neuronala cellbiologi är analyser av axonal transport med levande cell imaging nödvändiga för att förstå neuronal funktion och morfogenes1. Defekter i axonal transport ligger bakom flera neurodegenerativa sjukdomar2. Kinesin superfamiljen proteiner och dynein axonal transport anterogradely och utföra retrogradely, respektive1,2.
Cilierna är en annan mobilfack där det mikrotubulära nätverket och människohandel maskiner är högt utvecklade3. Proteinsyntes maskiner är inte lokaliserade i flimmerhåren, vilket innebär att ciliär proteiner måste transporteras från cytoplasman till flimmerhår tips. Cilier-specifika kinesin och dynein, kallas kinesin-2 och cytoplasmiska dynein-2, respektive, transportera komponenterna i flimmerhåren4, i ett fenomen som kallas intraflagellar transport (IFT)5. Nedskrivning av IFT orsakar ett spektrum av sjukdomar som kallas ciliopathies6. Således krävs analys av IFT mekanismen av levande cell imaging att förstå grundläggande mekanismer ciliär bildandet och patogenes.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en bra modell att studera axonal transport och IFT7,8,9. För att observera IFT, har Chlamydomonas varit allmänt används som en modell organism5,6. Chlamydomonas är en encellig organism, skulle förhållandet av IFT med åldrande, nervcellernas funktion och beteende vara svåra att analysera. Dessutom har viktiga genetiska tekniker såsom CRISPR/Cas9 inte tillämpats på Chlamydomonas. I högre modellorganismer, såsom möss och Drosophila, orsakar störningar av axonal transport och IFT ofta dödliga fenotyper eftersom axonal transport och IFT är väsentliga för morfogenes och homeostas av djur 10, 11. När det gäller möss behövs cellkultur och transfection generellt att iaktta axonal transport och IFT, vilket kräver många färdigheter och omfattande tid12,13. Dessutom förloras en hel del viktiga fysiologiska sammanhang i odlade celler och cellinjer. Eftersom nervsystemet inte är avgörande för överlevnaden av maskar, C. elegans mutanter som axonal transport eller IFT störs är ofta inte dödliga7,9,14. Axonal transport och IFT kan observeras direkt i vivo utan dissektion eftersom C. elegans är transparent och det är därför lätt att observera GFP-märkta markörer.
I området i närheten finns det flera protokoll att immobilisera C. elegans, till exempel med en mikroflödessystem enhet15, agaros pads med anestesi16eller mikrokulor17. Införandet av anestesi kan hämma människohandel händelserna i nervceller15. En klar nackdel för metoden mikroflödessystem-enhet är att förbereda en mikroflödessystem enhet inte är alltid lätt. Istället är immobilisering av agaros kuddar och mikrokulor ett bekvämt och enkelt sätt att utföra time lapse imaging i C. elegans. Här beskriver jag detta grundläggande protokoll för att immobilisera C. elegans och visualisera axonal transport och IFT i vivo i C. elegans. Jämfört med de andra metoderna, den metod som beskrivs här kräver inte särskild utrustning och är mycket billigare och lättare att utföra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begränsning med avseende på befintliga metoder
Den metod som beskrivs här är optimerad för att observera snabba händelser såsom axonal transport och IFT. Immobilisering är således mer prioriterat än längre inkubation. Medan vi har kunnat iaktta människohandel händelser i minst 20 min utan betydande störning, kanske denna metod inte alltid lämpligt att observera långsamma händelser som kräver längre observationer, som axon töjning och cellmigration. För längre observationer, måst…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren tack djupt Dr Asako Sugimoto (Tohoku University) för hennes bra diskussion. wyIs251 var en generös gåva från Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 och #16 H 06536 och Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation och Naito Foundation.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell’s antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell’s antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Génétique. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
