Summary
在心脏再生医学新的治疗策略需要广泛和详细的研究在大型前动物模型, 才可以考虑使用在人类。在这里, 我们演示了经皮超声心动图引导心肌注射技术在兔, 这是有价值的假说测试这种新疗法的功效。
Abstract
细胞和基因治疗是令人振奋的和有希望的策略, 以心脏再生的目的在设置心力衰竭与减少射血分数 (HFrEF)。在人们可以考虑使用和实施之前, 在大型动物模型中需要进行广泛的临床前研究, 以评估 injectate (如干细胞) 一旦被送到心肌的安全性、有效性和命运。小啮齿类动物模型提供好处 (例如, 成本效益, 可为基因操纵);然而, 鉴于这些模型的固有局限性, 这些发现很少转化为临床。相反, 大型动物模型, 如兔子, 有优势 (例如, 与人类和其他大型动物相比, 类似的心脏电生理), 同时保持一个良好的成本效益平衡。在这里, 我们演示了如何执行经皮超声心动图引导心肌注射技术, 这是微创, 安全, 耐受性好, 并非常有效的靶向交付 injectates, 包括细胞,在兔子模型的心肌内的几个位置。为了实现这一技术, 我们也利用了广泛使用的临床超声心动图系统。在实践了这里描述的协议之后, 一个具有基本的超声知识的研究人员将会胜任在实验中常规使用的这一多才多艺和微创技术的表现, 目的是假设测试家兔模型的心脏再生疗法的能力。一旦能力达到, 整个程序可以在25分钟内完成麻醉兔。
Introduction
细胞和基因治疗是令人兴奋和不断发展的策略, 以再生/修复损伤心肌 HFrEF。有几项研究比较了不同的细胞传递途径的有效性 (例如、细胞保留率), 这一结果始终如一地证明了在冠状动脉或静脉通路上的优越性,1,2,3,4,5. 因此, 对受损心肌干细胞治疗的转化模型研究的很大比例, 并不令人惊讶, 在一个开放的胸部手术中直接观察到的 injectate 通过在一个直视下进行,6,7.但是, 这种方法有几个限制, 包括程序的侵入性, 这会带来围手术期死亡的风险 (通常是报告的)8。此外, 直接视野下的一个人也不能排除无意中射入心室腔的可能性。在临床实践中, 在开胸手术中, 在冠状动脉旁路移植术 (搭桥) 过程中, 可以采用一种合适的治疗细胞分娩方法, 即例如。然而, 这种方法可能不适合在全球非缺血性心肌病 (如, HFrEF 继发于蒽诱发的心肌病 (AICM)) 的细胞分娩。
毫无疑问, 缺血性心脏病 (IHD) 是最常见的原因 HFrEF (约 66%)9,10; 然而, 非缺血性心肌病, 包括 AICM, 仍然影响了相当比例的患者与 HFrEF (33%)9.事实上, 最近在临床肿瘤学的进展已经导致超过1000万的癌症幸存者在美国单独11, 与一个类似的数字在欧洲的估计, 符合整体趋势, 以改善癌症患者的生存率12 ,13。因此, 探索新疗法的好处, 如干细胞移植治疗非缺血性心肌病, 以及法的有效和微创途径的干细胞传递是至关重要的, 鉴于越来越多的病人受抗癌药物心脏的影响。
值得注意的是, 假设测试的研究采用干细胞疗法, 目的是修复/再生受伤的心肌, 经常涉及使用小啮齿动物 (例如, 老鼠和老鼠)。这些模型通常需要昂贵的高频超声系统来评价心肌功能, 通常配有线性阵列传感器, 它们有一些固有的相关限制 (例如, 混响)14。然而, 其他模型, 如家兔, 代表一个大型的前临床模型, 有一定的优势, 假设测试的干细胞治疗在 HFrEF。因此, 与老鼠和老鼠相比, 兔子保持一个 Ca+2传输系统和细胞电生理学类似的人和其他大型动物 (如如, 狗和猪)15,16,17 ,18,19。另一个优势, 是他们的可的心脏超声成像使用相对廉价和广泛可用的临床超声心动图系统配备了相对高频率相控阵传感器,例如, 12 MHz, 如常用于新生儿和儿科心脏病。这些系统允许优秀的超声心动图成像技术的状态, 他们利用谐波成像的优越性20。此外, 广泛的假设测试的潜力心脏再生疗法 (如, 干细胞治疗), 其安全性, 疗效, 心肌的潜力, 以及评估的命运, injectate 一旦交付到心肌, 是强制性的, 才可以考虑为人类使用, 他们需要使用大型的前临床动物模型, 如兔17,19。在这里, 我们描述了一种微创技术, 通过经皮超声心动图引导下的细胞分娩的临床超声心动图系统, 这是针对干细胞移植治疗非缺血性心肌病20.我们还描述了印度墨水的好处 (InI, 也称为中国墨水) 作为一个超声造影剂和原位示踪的 injectate 在兔心脏。
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Protocol
本文所述的实验得到了西班牙穆尔西亚大学伦理研究委员会的批准, 并按照欧洲委员会 2010/63/欧盟的指令进行。所描述的步骤是在标准操作协议下执行的, 这些程序是工作计划的一部分, 没有仅为拍摄所附视频而执行。
1. 细胞和哺乳动物表达载体的制备
注意: 在这里, 我们简要描述了一个细胞系的制备和转染的协议 (人类胚胎肾脏 293 (HEK-293));但是, 应优化单元格类型的适当的特定单元格协议 (例如、干细胞)。
- 维持 HEK-293 细胞在高葡萄糖 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 中补充10% 胎小牛血清 (FCS), 1% 丙酮酸钠, 2 毫米谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 并在37° c 的湿润气氛中孵育, 含 5% CO2.一旦细胞是次汇合, 分裂的比率为1:3。
- 开始分裂细胞, 通过吸气介质, 然后用无菌磷酸缓冲盐 (pbs) 清洗一次, 除去过量的 pbs, 然后孵育2.5 毫升的0.5x 胰蛋白酶-乙酸酸 (EDTA) (5 分钟, 37 ° c)。
- 添加一卷 DMEM 介质 (如上所述) 以停止反应, 然后通过缓慢、轻柔地用电子吸管将细胞分离。
- 然后, 将电池悬浮液转移到适当的容器 (例如, 15-50 毫升圆锥离心管)。离心机在摆动桶 (100 x g) 中, 丢弃上清液, 用无菌 PBS 清洗两次颗粒。
- 重在新鲜的 DMEM 培养基和种子中的颗粒在适当的细胞密度 (例如, 1 x 106细胞在 75 cm2烧瓶) 在新鲜的文化烧瓶或大盘子根据地方实验室做法。
- 每2天用新媒体替换现有媒体。
注意: 表达式向量是从 pIRES1hyg 派生的, 并根据制造商的说明使用, 如前面所描述的21。p (EGFP) IRES1hyg 是由亚 EGFP cDNA 生成 BamHI + NotI 插入 pEGFP-N1 入 BamHI + NotI 消化 pIRES1hyg21。
- 每2天用新媒体替换现有媒体。
- 1天前转染, 种子 HEK-293 细胞在密度为 0.5 x 105细胞/cm2在 12-或 24-良好的组织培养板。
- 在转染的当天, 在单独的1.5 毫升离心管 (1 管/井) 中制备 DNA 脂质转染试剂配合物。
- 首先, 在每管中加入250µL 的降低血清培养基, 然后加入4µg DNA (轻轻混合)。
- 随后, 添加250µL 从以前准备的混合10µL 脂质转染试剂和250µL 的降低血清培养基, 每管 (再次轻轻混合)。
- 最后, 进行染, 通过孵化 HEK-293 细胞与 DNA 脂质转染试剂配合物4小时, 然后替换为 DMEM 培养基补充如上所述 (步骤 1.1), 并孵化另 48 h. 执行药物选择的稳定转100µg/毫升霉 B。
- 将 HEK-293 细胞与胰蛋白酶分离, 如上所述 (步骤 1.2)。在无菌 pbs 中清洗细胞后, 重在适当的车辆中 (例如, 在 pbs 中为10% 伏/v), 以达到 5 x 106/毫升的最终细胞浓度。
2. 兔的制备
注: 家兔的定位和换能器对动物心脏的形态和功能评价不理想。因此, 它是可取的执行一个完整的超声心动图检查20之前, 在该中心 (见下文), 并在随后的时间点, 由实验设计的定义。这将目的是评估心脏的基线解剖和功能特征的动物, 将接受注射, 并评估的效果, 在心脏功能。
- 以盲目的方式进行这项考试, 遵循美国兽医内科医学院和美国超声心动图协会的超声心动图委员会的指导方针/欧洲心血管成像学会22,23,24。
- 在整个超声心动图研究中同时获得1导联心电图 (ECG) 追踪。
- 麻醉兔与氯胺酮10毫克/千克, 结合 medetomidine 200 µg/千克, 肌肉注射 (贝聿铭)。
- 检查麻醉后10-20 分钟的麻醉水平。
- 使用理发钳广泛删除胸部的头发 (如, 在颈部以下的子剑区域) (图 1A)。
- 在右侧前肢 (mediocubital 区域) 的内部面和后肢 (mediotibial 区域) (图 1B) 中, 剃须1-2 厘米2的额外区域。
- 在四肢的剃光部位放置粘连心电图电极, 在手术过程中同步监测心脏节律 (图 1C)。
- 将动物放在褥疮仰卧位上的热毯上, 四肢伸展, 使用附在表上的外科胶带 (图 1C)。
- 确保耳朵向后弯曲后, 在兔子的头部/背部, 并在一个位置, 低于其前肢, 因为这有助于保持正确定位的动物胸部的整个过程。
- 在整个手术过程中 (100%、2-3 升/分), 允许动物自发呼吸, 同时用面罩管理氧气。
图1。家兔的制备.(A) 从胸腔剪发;(B) 从四肢修剪毛发;(C) 连接电极, 将双腿伸出的兔子放在热毯上。请单击此处查看此图的较大版本.
3. 经皮超声心动图在家兔中的应用
- 用洗必泰溶液清洗和消毒胸腔的皮肤。
- 根据目前的最佳做法, 在整个过程中使用无菌技术。
- 如有可能, 并在合理可行的情况下, 执行完全不育的程序, 包括但不限于使用无菌材料, 如长袍、手套、外科伤口窗帘、餐桌无菌敷料材料以及无菌超声波换能器盖和无菌超声凝胶。这将降低到最低的风险, 引入病原体的动物接受的, 是标准的做法, 在临床设置 (例如, 在心脏穿刺)。
注: 建议始终按照地方和国家的动物研究条例, 适用于当地的机构和国家的实践。
- 应用超声波传输凝胶到胸部和/或传感器, 并与传感器线周围的实验者的颈部, 执行快速窗口扫描的动物的心脏, 这往往是有益的可视化解剖和计划的。
- 将传感器手动放置在 4th-6 的th肋间间隙, 2-3 厘米远离右侧的胸骨线, 其入射角与胸壁右侧 (图 2A) 有关。
- 调整换能器相对于肋间间隙的位置, 以及它的前后和 dorsoventral 角, 以优化在乳突肌水平上的改良短轴视图。在此视图中确定右心室 (RV)、左心室 (LV)、室隔膜 (IVS)、后壁 (密码) 以及前外侧 (AL) 和内侧 (PM) 的乳突肌 (图 2B)。
- 通过在系统上使用适当的控件 (例如、按钮、拨号) 显著增加深度, 具有广泛的视野。
- 请特别注意在这个视图中获得对称图像, 以及适当地区分心内膜和心外膜轮廓, 并在必要时通过图像优化控制 (例如, 增益) 进行调整。
- 一旦获得了最佳的超声心动图 (图形 2B), 在整个过程的其余部分保持这个位置, 而第二个操作者执行的是 (见下文)。
- 在持有传感器的同时, 避免隐藏传感器方向标记, 它应该始终朝向前方, 从而允许在随后的步骤 (图 2A, C) 中与针对齐。
- 用24克针连接到1毫升注射器, 将针靠近左侧 hemithorax 的皮肤, 在一个对称的镜像位置相对于传感器。然后, 手动将针与传感器方向标记对准 ~ 90 ° (图 2C) 的角度, 并缓慢地将针穿过皮肤并进入胸腔。
注: 经皮穿刺针插入在这个位置和方向有助于在超声束的平面上的针的可视化 (图 2D, E), 从而允许实时监测, 必要时, 调整针相对于心肌靶区的位置 (图 2G, H)。 - 与尖端在目标位置, 缓慢地交付 injectate (高达0.25 毫升每个注射站点) 在10-30 秒内 (图 2E), 同时缓慢和轻轻地缩回针在注射期间增加心肌的治疗程度。
- 使用在 PBS 中稀释的 InI 10% (v/v) 来实现技术的标准化, 并在获得能力的同时作为原位示踪剂, 并通过大体病理和组织病理学确认在心肌内所有四个区的成功靶点 (见代表性结果)。一旦达到能力, InI 可以被一个合适的商业超声造影剂, 如果需要的替代。
注: 在 PBS 中使用或不带细胞的 10% (v/v) InI 的传递在注射靶点 (图 2E, F) 的壁 hyperechogenicity (即, 回声明亮的外观)。瞬变减速或加速心率, 与过早心室收缩 (例如, 孤立, 对联和三胞胎) 经常被观察甚而从针的第一接触与心外膜并且在和/或后不久。然而, 没有危及生命的心律失常的发展, 和急性不良反应是很少观察使用高达0.25 毫升 (1.25 x 106细胞) 的 injectate 每一个以上的注射站点 (见代表性结果和讨论)。
- 使用在 PBS 中稀释的 InI 10% (v/v) 来实现技术的标准化, 并在获得能力的同时作为原位示踪剂, 并通过大体病理和组织病理学确认在心肌内所有四个区的成功靶点 (见代表性结果)。一旦达到能力, InI 可以被一个合适的商业超声造影剂, 如果需要的替代。
- 在针的入射角度进行细微的变化, 必要时完成0.25 毫升的注射, 每四靶点的位置 (三在左心室游离壁 (LVFW) 和一个在 IVS)。
- 在完成经皮超声心动图引导下, 评价心脏节律 (如, 通过串口心电图跟踪和/或24小时动态心电图), 并进行序列窗口超声扫描, 以验证没有并发症, 直到该动物完全恢复从麻醉, 然后才转移到一个轻周期的房间。
- 在这里, 我们使用24小时动态心电图监测的影响, 与 InI 的心脏节律24小时。为此, 我们比较了一组6只正常表型 (正常组) 和6只接受静脉注射阿霉素的家兔 (一种心脏蒽药物, 通常用于治疗癌症;DOX 组) 的剂量为2毫克/千克/周8周, 然后两个队列收到了与 InI。
图 2.经皮超声心动图引导下心肌注射液在家兔中的比较.(A) 传感器在右 hemithorax 的位置 (以90°为角)。(B) 代表胸骨短轴观 (PSSX) 的心脏在兔的乳突肌水平的代表性图像。(C) 针在90°角上相对于传感器方向标记的对准。(D) 针在目标站点的位置, 以 PSSX 的角度观察 (注意, 针在超声束的平面上很容易被可视化)。(E和F) 在目标站点上的 hyperechogenicity 心肌注入印度墨水 (箭头突出显示壁 hyperechogenicity) 的演示。(G) 针在 LV 室中的意外位置 (箭头突出针轴)。(H) 将针重新定位到 LV 自由墙 (箭头突出了针轴)。RV = 右心室;LV = 左心室;IVS = 室隔膜;后壁;前外侧的乳突肌;PM = 内侧的乳突肌。请单击此处查看此图的较大版本.
4. 后的分析
- 对兔心脏组织标本进行病理组织学分析。
- 在10% 甲醛中修复 24 h 的组织, 其次是脱水, 乙醇浓度增加如下:
·1x 在 70% (60 分钟)
· 1x 95% ethanol/5%methanol (60 分钟)
·1x 在 100% (60 分钟)
·1x 在 100% (90 分钟)
·1x 在 100% (120 分钟)
注: 以上孵化均以室温 (RT) 进行。然后, 以100% 二甲苯 (1 h, RT) 两次替代, 最后在石蜡中嵌入两个步骤 (60 分钟, 58 ° c)25。 - 使用切片25执行4-5 µm 组织切片。在幻灯片上装载节。
- 用苏木精-曙红和马尾松的三方法进行染色25,26,27。
- 在10% 甲醛中修复 24 h 的组织, 其次是脱水, 乙醇浓度增加如下:
- 在移植心脏组织切片, 执行免疫组化检测 EGFP (+) HEK-293 细胞 (例如, 使用素生物素复合物 (ABC) 方法), 简要:
- De 蜡4-5 µm 厚的心脏部分在100% 二甲苯 (10 分钟, 在 RT)。用降低乙醇浓度溶液洗涤水化组织 (2x 在 100% (2 分钟); 2x 在 95% (2 分钟); 1x 在 70% (2 分钟); 1x 在 50% (2 min); 1x 在 30% (2 分钟); 1x ddH2O (2 min)) 在 RT。
- 通过覆盖100µL 3% h2O2稀释的甲醇 (用 5 ml 30% 毫升的 h2O2, 并加入甲醇达50毫升的总容积) 来进行内源性过氧化物酶抑制 (孵育30分钟, RT), 然后用三缓冲盐水浸泡 (TBS; pH 值 7.6)。
- 通过酶处理进行抗原揭露, 通过覆盖100µL 0.1% 蛋白酶 (0.01 g 蛋白酶稀释10毫升 tbs) (孵育12分钟, rt), 然后用 tbs 洗涤 (5 分钟, rt) 的部分。
- 用100µL 每张幻灯片 (30 分钟, rt), 用 tbs 冲洗 (5 分钟, rt), 在阻断溶液中孵育 (正常的山羊血清, 10% 在 tbs)。
- 孵化与鸡抗绿色荧光灯蛋白 (GFP) 作为主要抗体 (1:500 在 tbs) (1 小时, 30 ° c) 和洗涤与 TBS (5 min, RT)。
- 用二次抗体孵育化山羊抗鸡 IgG (1:250 在 tbs) (1 h, 30 ° c), 然后洗涤与 TBS (5 min, RT)。
- 孵育与素-生物素复合体 (20 分钟, 30 ° c), 然后标签使用 330-diaminobenzidine tetrahydrochloride (民建联) (RT, 5-10 min)。
- 最后, 在增加乙醇浓度的洗涤中脱水 (1x 在 30% (2 分钟); 1x 在 50% (2 分钟); 1x 在 70% (2 分钟); 2x 在 95% (2 分钟); 2x 在 100% (2 分钟)) 在 RT, counterstain 部分使用苏木精-曙红方法25, 然后装入封面幻灯片。包括正的、负的以及同种的控制。
注: 上述简短的协议并不打算用于一般免疫组化使用;最优化的组织的利益和条件是必要的。
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Representative Results
经皮超声心动图引导下与 InI 对照:
使用上述协议, 一旦针尖的最佳定位通过超声心动图和注射启动, 壁 hyperechogenicity 观察在交付的 InI (10% 伏/v 在 PBS) (图 2E), 以及后不久, 到目标区域 (图 2F)。当他紧接着被安乐死和心脏移除后, 在心脏外部检查时很容易看到有 InI 的沉积物 (图 3A)。另外, 心脏组织部分,例如, 短的轴段在水平的乳突肌 (图 3B), 显露了壁沉积的 InI 染料在射入站点, 因而证明成功和有效地交付用这种方法 injectate 进入心肌。注意, 壁 hyperechogenicity 观察到在体内期间 (图 2E, F), 与 InI 的壁矿床在前体内标本 (图 3A, B) 相关。这清楚地表明, InI 在该设置中具有双重属性: 作为一个体内超声造影剂, 以及一个前 vivoin 原位跟踪器。这两种性能都使 InI 成为一种非常通用且价格低廉的超声造影剂, 特别是在这项技术的能力获得培训期间。因此, InI 的回声属性帮助监视了例如, 确定了成功的与意外的内腔或心包间隙注射, 并在必要时, 鉴于超声的实时成像能力, 使实时更正针轨 (图 2G, H)。另一方面, InI 的原位跟踪功能对于在目标心肌的前体标本中定位 injectate 是有价值的。
经皮超声心动图引导下 EGFP (+) HEK-293 细胞:
在 EGFP 之前, 在体外培养条件 (图 3C) 中, 荧光显微镜证实了 HEK-293 细胞的成功转染。通过对 EGFP (+) HEK-293 细胞的免疫组化分析, 证实了其在心肌组织中的成功传递。因此, 使用素-生物素复合方法 (见步骤 4.2), 丰富的 EGFP (+) HEK-293 细胞被确定在与 InI 沉积的心肌中 (图 3D)。从兔的心肌组织样品中, EGFP (+) HEK-293 细胞 (图 3E), 或单独使用 ini (图 3F) 后, 仍观察到24小时的 ini 沉积物。值得注意的是, 在这个时间点, 一个急性炎症反应的观察, 主要的中性浸润, 从动物的样本接收 EGFP (+) HEK-293 细胞 (图 3E), 从而建议急性细胞排斥。另一方面, 在接受 InI 的动物中观察到巨噬细胞 (图 3F)。
图 3.原位injectate 的宏观和组织病理学评价和追踪.(A) 演示 injectate 在离体后的心脏外检查中的存在 (箭头突出了注射部位)。(B) 演示壁分布的 injectate 后与 InI 在一个横向部分的心脏, 在水平的乳突肌 (蓝色箭头突出壁 InI 矿床; 白色箭头突出显示的可见矿床InI 在 IVS)。(C) 使用荧光显微镜对 EGFP (+) HEK-293 细胞进行自发荧光体外。(D-F)注射部位的组织病理学分析。EGFP (+) 细胞明显地穿插在 0 h (D) 和 24 h (E) 后的心肌中的 InI 沉积物 (蓝色箭头突出 EGFP (+) 细胞; 红色箭头突出显示中性粒细胞)。在 24 h (F) 后, 在与 ini 单独 (蓝色箭头突出显示巨噬细胞的存在) 后, 在心肌内散布的 ini 沉积物。RV = 右心室;LV = 左心室;IVS = 室隔膜;心肌注射液;InI = 墨汁。请单击此处查看此图的较大版本.
经经皮超声心动图引导的60以上的实验, 我们相信, 在细致的注意细节和良好的动物处理和护理, 程序通常是很好的耐受性, 急性并发症是非常罕见的通常是温和的。一般情况下, 在动物接受的过程中, 最常见的观察期间和后不久的程序是瞬变加速或心率减慢, 与孤立的早产儿心室配合物 (PVC) (图 4A)。因此, 24 小时的动态心电图监测的动物, 收到单独的 InI 通过, 显示, 最常见的心律失常检测 (总次数在24小时内) 被隔离 PVC, 即使有更多的情节被发现在动物以前用 DOX 处理8周 (图 5A)。PVC 对联和三胞胎似乎不太频繁 (图 4B, C和图 5B, C), 即使三胞胎在 DOX 治疗中的频繁程度明显低于未经处理的正常家兔 (图 5C)。另一方面, 非持续性室性心动过速 (NSVT) 在正常动物 (图 4D和图 5D)中更常见。显着, 虽然 DOX 和正常组的平均心率在接受了单独的 InI (图 5E) 后, 正常 r r 区间 (SDNN) 的标准差明显减少 (< 100 毫秒), 但 DOX 组 (图 5F)。SDNN 是心脏健康状况的一种非线性指标, 因此这一结果表明 DOX 组在心脏生理状态上有全球性的改变。
图 4.在24小时动态监测中观察到的家兔的室性心律失常.所显示的图像是从屏幕上显示的动态心电图 tachograms 在离线分析过程中获得的截图, 并举例说明最常见的类型的心律失常发现在24小时的监测。(A) 隔离的 PVC。(B) 用对联的 PVC。(C) 聚氯乙烯为三胞胎。(D) NSVT。PVC = 早产儿心室收缩;NSVT = 非持续性心室心动过速。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.心律事件检测 24 h 动态心电图监测后, 与 InI 与兔.隔离 pvc (A) 的总数量, 在对联中的 pvc (B), PVC 在三胞胎, (C) 和 NSVT (D), 在未经处理的兔 (正常 + 中) 与阿霉素治疗 (3 毫克/千克/周6周) 兔 (DOX +), 在与 InI。平均心率 (E) 和 SDNN (F), 在正常的家兔和 DOX + 与 InI 后的基带。数据被表示为平均± SEM. * 表示p < 0.05;和 # 指示p < 0.01, 通过t-测试比较正常 + DOX 与非 "基" 组的对比。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
主要目的是开发一种微创技术, 可用于将干细胞输送到家兔的心肌 (一个大型的临床前动物模型)17,18, 同时利用相对低廉的成像系统在许多临床和研究中心随时可用。在这里, 我们表明, 使用临床超声心动图系统, 并辅以 InI, 一个广泛可用的代理, 既具有原位跟踪能力和回声的性质, 成功的经皮超声造影引导下, 是非常有效的把 injectate 送到兔子心脏的靶区据我们所知, 这是第一个描述经皮超声心动图引导下的和细胞传递在一个大型动物模型, 如兔18,19。虽然 InI 已用于研究中的原位本地化的 injectate 在组织内7,28, 这是我们的知识, 第一次描述这个代理的双重属性作为一个在体内超声造影剂和作为一个原位示踪 injectate 的ex 体内。事实上, 以前的小鼠研究中描述了对比剂和原位追踪物质的复合混合物, 目的是将 injectates 送到心肌中29。然而, 鉴于 InI 的回声属性和它的原位跟踪功能, 这种物质在接受这种技术训练的同时, 在能力获取过程中可能非常有用。
使用免疫组织化学方法证实含有 InI 和 EGFP (+) HEK-293 细胞的 injectate 的交付, 表明该技术在干细胞治疗的临床前研究中的适用性。与 EGFP (+) HEK-293 联合使用的一个人, 导致急性炎症反应与主要中性浸润, 提示急性细胞排斥反应 (24 小时内) 异种细胞。这种反应可能是不足为奇的免疫动物。另一方面, 与 InI 单独的一个人也引起急性炎症反应 (在24小时内) 的治疗心肌组织, 其中表现出一个主要的巨噬细胞浸润。这与先前研究中所描述的急性炎症的观察是一致的, 在一个开放的胸腔程序中, 在直接的视野下,4,30,31,32,33。急性炎症也被观察后, 注射生理盐水或 PBS 溶液进入心肌34,35, 甚至进入大鼠的腓肠肌肌肉的36, 因此此响应已归因于直接组织损伤而不是 injectate 本身. 30,31,32,34,35,36事实上, 国际心血管转化研究学会承认在该地区的环境中常见的炎症发生, 但对于是否采取措施减少这一过程, 在围手术期是有用的 (例如, 静脉注射 (静脉注射) 皮质类固醇)37。即使这项研究中的炎症也可以归因于直接组织损伤, 结果也表明, ini 作为一个异物也必须发挥作用, 在这个过程中, 如果一些巨噬细胞似乎是吞噬 InI (图 3F)。深入分析这种急性炎症继发于心脏内, 或是否可以通过服用皮质类固醇等预防性药物而得到改善的功能性效果, 超出了本手稿的范围。然而, 经皮超声心动图引导的 injectate 在心肌的四靶区, 其体积为0.25 毫升 (1.25 x 106细胞) 的每一个区域, 是非常良好的耐受性在兔子。
迄今已执行了60多个程序, 在完成能力后, 该程序的死亡率很低。例如, 在3.9 步 (正常和 DOX 组) 中描述的两个队列中没有发生死亡。事实上, 到目前为止, 作为一个正在进行的研究项目的一部分, 在67的过程中, 我们只有两个死亡直接相关的程序 (2.9% 死亡率)。在其中之一, 心包的存在在验尸检查中得到了证实, 而其他的临床神经系统体征与性事件的急性脑缺血相一致, 因此需要人性化的终结点。此死亡率 (2.9%) 明显低于 Lu et al.报告的水平(11%)8和 Mu et al. (27%)38, 在开放的胸部手术中接受了直接查看的兔。因此, 我们认为在目前的研究中所描述的程序是安全的, 我们正在使用这项技术进行研究, 以评估干细胞为基础的 AICM 兔模型的治疗, 有希望的结果39,40。
经皮超声心动图引导的成功, 有几个关键点。首先, 确保在胸骨的短轴视图的水平上的乳突肌是获得清晰的界定, 心内膜和心外膜轮廓。其次, 确保针尖是在所有时间内的视野, 一旦这已进入胸腔和心肌, 以防止意外分娩到心包腔或 LV 室。然后, 确保保持最小的通道数通过胸腔, 并进入心包和心肌, 因为这可能会增加局部创伤 (如, 撕裂伤) 的可能性, 这些结构, 和相关的风险心包.为此, 同时保持在胸腔内的针 (和一些目标部位, 在同一进入点的内脏心包 (如, 侧壁), 仔细执行微妙的变化的角度, 针的发病率。最后, 始终使用针, 有一个清晰和容易通过皮肤进入胸腔, 从而避免钝针斜面进入心肌, 并造成重大损害。
本文所述的程序, 不仅允许可靠和成功地将 injectate 送到心肌中的几个目标部位, 而且还允许实时修正针轨, 从而防止意外 intrachamber 的发生 (图 2G, H)。虽然在小鼠前面已经描述了闭合性胸原的过程, 但这种小动物模型固有的一些局限性。这些限制包括接受治疗的心肌靶区的数量, 以及每个目标站点29,41中可以注入的低容量/单元数。此外, injectate 的准确交付通常是一个关注, 成功率接近 60-70%42, 因此使用不太广泛的高频超声系统通常是必需的29,41, 42。这些系统配备了线性阵列传感器, 也具有固有的成像限制 (例如, 混响是常见的工件)14。小鼠模型的另一个局限例如老鼠和老鼠, 是他们的内在区别在 Ca+2运输系统和细胞电生理, 不同于人和大动物模型例如狗、猪和兔子15,16,43。所有这些限制往往造成困难, 把这些模型的结果转化成诊所没有事先确认在一个大型动物模型。
在围手术期内对动物进行仔细的监测是强制性的, 这是根据当代动物保育指南。如图所示, 这可能是由串行超声心动图窗口扫描和心电图脉象, 至少直到动物是清醒的麻醉。24 h 动态心电图对心电节律的急性影响也可进行监测, 是我们的标准做法。值得注意的是, 最常见的心律失常是孤立的聚氯乙烯, 这是相对良性的性质, 这是更普遍的动物, 已被治疗的阿霉素之前, 与 InI (见图 4A和图 5A)。其他较不常见的心律失常包括: PVC 对联;PVC 三胞胎;以及 NSVT (请参见图 4B-D和图 5BD)。然而, 没有生命威胁的心律失常, 如持续性室性心动过速观察。注意, 我们还发现, DOX 组中的一些心脏表现可以通过动态心电图监测, 利用心率变异性 (HRV), 如 SDNN 的时频域变量来检测。因此, 与正常组相比, 在 DOX 组中观察到一个减少的 SDNN (图 5E, F), 一种非线性的心脏健康状态测量。这是第一次报告的减少 HRV, 证明由减少 SDNN, 在一个兔子模型的背景下, AICM, 这是符合的观察, 减少 SDNN 是一个强大的独立预测心脏死亡的患者 HFrEF44 ,45,46。DOX 组 SDNN 的改变可能与该过程本身无关;然而, 在接受阿霉素的兔子, 以及不受普通动物的影响的情况下, 证实这些结果是必需的。是否减少 SDNN 在 HFrEF 也可以改善, 因此作为一种替代措施的好处, 干细胞为基础的治疗, 仍有待评估, 并将成为未来的研究重点。
已经探索了一些将细胞送到心脏的途径, 包括静脉注射、冠状动脉造影和心肌分娩;但是, 此处使用的心肌路由始终显示了最高水平的单元格保留率1、2、3、4、5、37。我们没有评估在这里提出的研究中的细胞保留率, 因为使用的方法是不够健壮和具体的, 足以定量这个在体内或ex 体内, 这是这项研究的局限性。相反, 我们使用 EGFP (+) HEK-293 细胞, 其表型特征使我们能够很容易地辨别这些细胞在心肌中的存在, 从而表明成功的心肌分娩。然而, 其主要目的是开发一种微创技术, 使我们能够在一个大的, 非缺血性心肌病的临床前模型中, 对心肌进行心脏和细胞的传递。如图 2和图 3所示, 这是第一次通过经皮造影超声心动图指导的。进一步的研究是必要的, 以评估细胞保留率, 以及任何潜在的有益效果的干细胞交付到心肌使用的过程中所描述的;这些研究目前正在进行中。我们最近在功能效果方面传达了有希望的结果39,40。
经皮超声心动图在本研究中所述的大型临床前模型中, 与在胸腔开放手术中的对比, 在自然中具有明显的侵入性, 并在手术后快速恢复, 并作为如上所述, 它也有较低的死亡率8,38。另外一种方法是以导管为基础, 它也已经在临床前模型和几个小的试验中进行了测试 (为审查, 看见盛et al.)47. 通过这种方法, 导管被推进到 LV 腔, 然后定位在心内膜内的目标位置。这些目标站点是在过程之前确定的,例如, 使用对比心磁共振成像 (CMR)48, 或在过程中,如, 由机电心内膜映射 (EEM), 以清楚地在注入49之前区分存活的心肌。这后一种方法是较少的侵入相比, 开放胸部的直接视野, 这是一个明显的优势。此外, 由于 IHD 在人类有一个零散的分布, EEM 帮助指导的治疗, 具体到可行的部位的心肌, 这是特别重要的设置 IHD。然而, 一个主要的缺点是诱导室性心律失常, 这是一个共同的特点, 所有的方法。其他缺点包括冗长的程序时间, 提供 EEM 是一项要求广泛的训练和相关的心脏穿孔风险的高要求的技术。相比之下, 经皮超声心动图在本研究中所描述的, 技术上是比导管基的更少的要求, 而且, 一旦能力达到, 它可以在麻醉后25分钟内安全执行。同样, 因为只有一小部分的针头被推进到心肌, 有一个较低的风险, 心脏穿孔, 虽然心脏撕裂伤仍然是可能的。
总之, 本研究中所描述的经皮超声心动图技术在大型动物模型中的应用, 如家兔16,43, 是安全的, 耐受性好, 有效地将 injectate 送到心.因此, 在非缺血性心肌病 (如, AICM) 的临床前假说测试中, 它是一种有希望的策略, 包括但不限于干细胞基础治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢希拉 Monfort, 布伦达. 马丁内斯, 卡洛斯 Micó, 阿尔贝托ñ oz 和曼努埃尔-莫林在收集数据时提供了出色的支持, 而卡洛斯布埃诺提供了 EGFP (+) HEK-293 细胞。这项工作得到了部分支持: 基金会 Séneca、75,000 de Ciencia Tecnología、西班牙穆尔西亚 Región (JT) (赠款号: 11935/PI/09);红 de Terapia 细胞, ISCIII-潜艇gral.Redes, VI PN i + D + i 2008-2011 (格兰特号。RD12/0019/0001) (JMM), 由欧洲联盟 (菲德) (JMM) 的结构筹资共同出资;并且, 英国的读书大学 (AG, GB) (中央资助)。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备原稿方面没有作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HD11 XE Ultrasound System | Philips | 10670267 | Echocardiography system. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz phase array transducer |
| Ultrasound Transmision Gel (Aquasone) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | over-the-needle catheter |
| Omnifix-F 1 ml syringe | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamine) | Merial | RN 9767 | Veterinary prescription is necessary |
| Domtor (Medetomidine) | Esteve | CN 570686.3 | Veterinary prescription is necessary |
| Heating Pad | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | India (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter ECG system. |
| Electrodes Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter ECG electrodes. |
| Microtome | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Microscope | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector Elite | Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Chicken anti-GFP antibody | Invitrogen | A10262 | Primary antibody. |
| Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-9010 | Secondary Antibody. |
| 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluorescence Microscope | Carl Zeiss MicroImaging |
Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter ECG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Fisher Scientific | 11965084 | |
| 10% fetal calf serum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent) | Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | 31985070 | |
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylene (histological) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Hydrogen Peroxide Solution (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
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