Summary
Questo protocollo descrive l'analisi del lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering dovuto il cammino casuale di una singola molecola su una superficie d'argento utilizzando leggi di potenza.
Abstract
Da una singola molecola in un incrocio di nanoaggregati argento, lampeggiante superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è osservato. Qui, un protocollo è presentato su come preparare il SERS-attivo argento nanoaggregati, registrare un video di alcuni punti lampeggianti dell'immagine microscopica e analizzare le statistiche di lampeggiante. In questa analisi, una legge di potenza riproduce le distribuzioni di probabilità per eventi luminosi rispetto alla loro durata. Le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri sono dotate di una legge di potenza con una funzione esponenziale. I parametri della legge di potere rappresentano il comportamento molecolare negli Stati sia chiaro e scuri. Il modello di random walk e la velocità della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimati. È difficile stimare anche quando si utilizzano medie, funzioni di autocorrelazione e super-risoluzione SERS imaging. In futuro, analisi di legge di potenza dovrebbero combinarsi con imaging spettrale, perché le origini del lampeggiante non possono essere confermate da questo metodo di analisi da solo.
Introduction
Superficie-enhanced Raman scattering (SERS) è altamente sensibile spettroscopia Raman da una superficie di metallo nobile. Poiché lo spettro Raman fornisce informazioni dettagliate sulla struttura molecolare sulla base delle posizioni di picco acuto, attraverso i modi vibrazionali di gruppi funzionali nelle molecole, è possibile analizzare le informazioni di una singola molecola su una superficie metallica usando SERS1,2,3. Da un argento nanoaggregati con un adsorbato a livello di singola molecola, un segnale lampeggio è osservato1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16e lo spettro fluttua1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. Lampeggiante può essere indotta da una singola molecola che casualmente si muove dentro e fuori un maggiore campo elettromagnetico (EM) in un incrocio di nanoaggregati d'argento di dimensioni nanometriche. Di conseguenza, lampeggiante è considerato prova semplice per il rilevamento di singola molecola, confrontato con una tecnica che utilizza una distribuzione di Poisson di intensità di SERS e un bi-analita2,3,17. Tuttavia, i meccanismi dettagliati dello spettro lampeggio e fluttuante, che può dipendere fortemente il comportamento molecolare sulla superficie Ag, sono ancora controversi.
Negli studi precedenti, lampeggiante SERS è stato analizzato utilizzando la funzione di autocorrelazione, che può calcolare il coefficiente di diffusione e la concentrazione delle molecole in movimento dentro e fuori un'avanzata EM campo12,13,14 . Inoltre, un punteggio di deviazione standard normalizzata, che rappresenta instabilità dell'intensità totale, è stato derivato dal profilo tempo del segnale15. Tuttavia, questi approcci analitici possono basarsi sul comportamento di alcune molecole. Al contrario, in un imaging di Super-risoluzione del lampeggiante SERS, comportamento di singola molecola in un maggiore campo di EM può essere identificato16. Tuttavia, queste tecniche possono ottenere tali parametri solo in un maggiore campo di EM. Il comportamento casuale di una singola molecola all'interno di una vasta gamma (per esempio, nel lampeggiante SERS) può essere rappresentato come una legge di potenza piuttosto che una media4,5,6,7,8 ,9,10,11, simili a fluorescenza lampeggia da un singolo semiconductor quantum dot (QD)18,19. Utilizzando un potere legge analisi4,5,6,7,8,9,10,11, comportamento molecolare può essere stimato in stato brillante (nel campo EM avanzato) sia stato scuro10; ovvero, il comportamento della molecola su tutta la superficie d'argento può essere stimato.
Per questa tecnica, argento colloidale nanoaggregati sono usato4,5,6,7,8,9,10,11. Questi nanoaggregati mostrano varie bande di risonanza (LSPR) plasmonica di superficie localizzata che influiscono fortemente rafforzate campi elettromagnetici quando sono eccitati a determinate lunghezze d'onda. Così, argento SERS-attivo nanoparticelle presenti in sospensione colloidale e alcuni dati immediatamente possa essere ottenuto. Nel caso di semplice nanostrutture, che hanno accordi, forme e dimensioni specifiche, la dipendenza di LSPR della SERS lampeggiante può celare altre dependences7; vale a dire, se la nanostruttura buona o cattiva a LSPR viene utilizzata, i parametri sarà costanti, e le altre dipendenze pertanto saranno nascosto. Analisi della legge di potenza sono stato utilizzato per scoprire varie dipendenze della SERS lampeggiante da argento colloidale nanoaggregati4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.
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Protocol
1. preparazione del campione
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Preparazione di nanoparticelle di argento colloidale 20
- Per fabbricare le nanoparticelle d'argento colloidale, sciogliere 0,030 g di nitrato d'argento e 0,030 g di citrato trisodico biidrato in 150 mL di acqua in un pallone a fondo tondo 200 mL.
- Combinare la beuta con un refrigerante a ricadere (Dimroth).
- Agitare la soluzione in un matraccio con una barra magnetica di agitatore e mescolare. Quindi, riscaldare la soluzione mescolando nel matraccio in bagno d'olio a 150 ° C per 60 min.
Nota: La soluzione diventerà grigio giallo, poi latteo. - Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente e a mantenere la sospensione nel pallone coperto con foglio di alluminio in frigorifero.
Nota: Il protocollo può essere sospesa a questo punto. Utilizzare le nanoparticelle colloidali, dopo la conservazione in frigorifero, entro un mese.
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Preparazione del campione per multi-colorato lampeggiante emissione 11
- Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.
- Aggiungere 0,1% soluzione acquosa di poli-L-lisina per la lastra di vetro e rimuovere la soluzione con un ventilatore.
- Aggiungere la sospensione colloidale d'argento per la lastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.
- Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.
- Acqua distillata goccia sulla lastra di vetro e coprire con un'altra lastra di vetro per creare un vetrino da microscopio e impedire l'evaporazione di acqua.
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Preparazione del campione per monotono SERS lampeggiante colorato 7 , 8 , 9 , 10
- Per preparare un vetrino da microscopio, lavare a mano, una lastra di vetro con sapone e risciacquare con acqua.
- Mescolare la sospensione colloidale d'argento con la tintura di thiacyanine o thiacarbocyanine (25 o 4 µM, rispettivamente) e una soluzione acquosa di NaCl (10 mM) a un rapporto volumetrico di 2:1:1.
- Eliminare la sospensione del campione sulla piastra di vetro e rimuovere la sospensione con un ventilatore.
- Racchiudere un'area di rilascio sulla lastra di vetro con una penna di liquido bloccante.
- Goccia di una soluzione acquosa di NaCl (1 M) sul piatto di vetro per immobilizzare le nanoparticelle d'argento e coprire con un'altra lastra di vetro per creare una piastra di scorrimento microscopio e impedire che la soluzione di evaporazione.
2. osservazione del lampeggiante nanoparticelle d'argento
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Illuminazione del campione
- Posizionare la piastra di vetro di campione preparata con protocollo 1.2 o 1.3 sulla scena di un microscopio invertito.
- Illuminare la lastra di vetro del campione usando la luce bianca attraversa un condensatore per campo oscuro e la messa a fuoco su vari punti colorati (blu, verde, gialli e rossi) sulla lastra di vetro utilizzando una lente obiettiva (60 X).
- Illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di luce attenuata, consegnato ad un angolo di 30° rispetto alla superficie del campione, da un laser a diodi a stato solido pompato (DPSS) continuo-fluttui (cw) attraverso un filtro antidisturbo.
- Per utilizzare laser illuminazione per osservare l'argento nanoaggregati come macchie di colore monotoni in zona dello stesso colore, spostare l'area di illuminazione laser al centro della vista e concentrarsi sui punti sulla lastra di vetro regolando la fase nella direzione z.
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Osservazione del lampeggiante
- Inserire un filtro passa-lungo dopo la lente dell'obiettivo e illuminare la lastra di vetro di campione utilizzando un fascio di cw-laser DPSS consegnato ad un angolo di 30° rispetto la superficie del campione attraverso un filtro antidisturbo.
- Trovare il lampeggio macchie come mostrato in Figura 1 (Vedi anche Figura S1 nel materiale supplementare) spostando il palco nelle direzioni x e y.
- Registrare video dei luoghi lampeggianti con il microscopio invertito, accoppiato ad una fotocamera raffreddato digitale charge coupled device (CCD), che ha una risoluzione temporale di 61-120 ms, per 20 min.
3. analisi del lampeggiante SERS
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Derivazione del profilo di tempo dal video
- Nel software che controlla la telecamera CCD, aprire il file video.
- Per selezionare i punti lampeggianti e zona scura, trascinare aree che coprono separatamente aree con e senza macchie nell'immagine video.
- Per derivare i profili orario di intensità di segnale dal lampeggiante macchie e aree scure nel video, selezionare Analisi temporale nell'analisie fare clic su Calcola nella finestra Analisi temporale .
- Salvare i dati come file di testo.
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Analisi del profilo tempo
- Appiattire una previsione del profilo orario sottraendo il profilo orario dall'area scura e/o raccordo con una funzione polinomiale, come mostrato nelle figure 2A e 2B.
- Valutare un'intensità media della linea di base che consiste di circa 2000 punti, iobasee una deviazione standard di intensità della linea di base, σ, come mostrato nelle figure 2 e 2D.
- Distinguere eventi luminosi da eventi oscuri con maggiore intensità di una soglia di hobase + 3 σ e registrare la durata di ogni evento. Nella Figura 3, ad esempio, registrare l'evento da 0 a 3.5476 s come l'evento scuro (con una durata di t = 3.5476 s) e registrare l'evento da 3.5476 a 4.0981 s come l'evento luminoso (con una durata di t = 0.5505 s). Ripetere la procedura come indicato nella tabella 1.
- Contare il numero di eventi di chiari e scuri per ogni durata, come espresso nelle linee prime e seconda della tabella 2.
- Sommare il numero di eventi per ogni durata, fatta eccezione per eventi più brevi di durata t. Come espresso nella seconda e terza riga della tabella 2, ad esempio, sommare il numero di eventi per ogni durata (fatta eccezione per gli eventi per t = 0.0612 s) come 41 + 18 + 9 +...; il risultato è uguale la somma per t = 0.1223 s, cioè 103.
- Dividere le sommatorie per ogni durata e normalizzarli. Come espresso nella tabella 2, per esempio, dividere la somma per durata t = 0.0612 s dalla durata 0.0612 s. Il risultato è 3,351.5791. Poi, dividere il risultato per il totale dei risultati nella quarta riga nella tabella 2. La distribuzione di probabilità è derivata per essere 0.64494.
- Tracciare le distribuzioni di probabilità per il brillante eventi Psu(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e montare Log10Psu(t) di Log10 (
) per dedurre il power legge esponente αsu per uno specifico lampeggio spot. Se Psu(t) viene montata dal , la linea componibile devia dai terreni a piccoli valori di Psu(t), come indicato dalla linea tratteggiata in Figura 4A. - Tracciare le distribuzioni di probabilità per eventi oscuri Poff(t) contro la loro durata t in un grafico del logaritmo logaritmo e Log10Poff(t) in forma di Log10(
dedurre power legge esponente αfuori e il troncamento tempo τ dal lampeggio stesso spot. Se Poff(t) viene montata dal , la curva si discosta dai terreni a piccoli valori di Poff(t). - Ripetere 3.2.1 a 3.2.8 per gli altri punti lampeggianti nel video.
dedurre power legge esponente αfuori e il troncamento tempo τ dal lampeggio stesso spot. Se Poff(t) viene montata dal Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dall'argento nanoaggregati con poli-L-lisina preparato dal protocollo 1.2, si osservano macchie multicolore lampeggiante da SERS e superficie-enhanced fluorescenza, come illustrato nella Figura 111. Al contrario, monotoni punti colorati lampeggiante da SERS sono stati osservati per i nanoaggregati d'argento con le molecole di colorante preparate dal protocollo 1.37,8,9,10. Ci sono due tipi di risultati "negativi": risultati di continui, o risultati dove non si è osservato nessun SERS. I risultati precedenti e quest'ultimi possono essere causati dalle alte o basse concentrazioni di molecole sulla superficie d'argento colloidale, rispettivamente.
I segnali provenienti da un singolo nanoaggregati argento mostrano varie intensità in tempi diversi, come illustrato nella Figura 2B. Questo è diverso dalla fluorescenza lampeggia di un singolo QD. Gli istogrammi dell'intensità di fluorescenza mostrano due picchi distinti, che rappresentano gli stati chiari e scuri18. Il profilo di tempo in un lungo intervallo è simile alla sua espansione in un breve intervallo, come illustrato nella Figura 34. Ciò si riferisce a come 'auto-similarità' o 'frattale'; vale a dire, le caratteristiche degli oggetti sono considerati simili se loro scale di lunghezza vengono espansi.
In un grafico del logaritmo logaritmo, le distribuzioni di probabilità per gli eventi di chiari e scuri sono tracciate contro loro durate come una linea e curva, rispettivamente, come mostrato in Figura 4 (in contrasto con il lampeggio da un singolo QD)19. Nel grafico, la pendenza della retta corrisponde all'esponente di legge di potenza. Al contrario, il più breve tempo di troncamento è dedotta dal fatto che la legge di potenza per lo stato scuro viene troncata a coda più corta. Per l'evento SERS scuro, le distribuzioni di probabilità sono montate occasionalmente da una legge di potenza piuttosto che da una funzione esponenziale. Cioè, tempi molto lunghi troncamento con grandi errori a volte sono derivata9,10. Tuttavia, non si tratta di un risultato "negativo" che una legge di potenza con una funzione esponenziale non può riprodurre le distribuzioni di probabilità per un evento SERS scuro.
Il potere legge esponenti αon/off e troncamento volte τ dedotta dalle singole nanoparticelle d'argento Visualizza diversi valori, come visualizzato nella Figura 5. Dai molti esponenti di legge di potenza, una media con un errore standard è derivata e rispetto ad altri valori in varie condizioni. Nel caso di tempi di troncamento, la mediana, piuttosto che media può essere adatto per il confronto. Fortunatamente, una pletora di dati possa essere raccolti da diversi video del lampeggiante, perché circa una dozzina lampeggiante punti possono essere osservati simultaneamente nel video.
Figura 1: immagini rappresentative della SERS lampeggiante. Punti lampeggianti multicolore sono osservati da argento nanoaggregati con poli-L-lisina. Barra della scala = 10 µm. Questo è preso con un microscopio invertito accoppiato ad una telecamera a colori CCD attraverso un passaggio lungo filtro (Vedi filmato video corrispondente in Figura S1 del materiale supplementare). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (A) profilo di tempo rappresentativo dell'intensità del segnale intermittente spot. (B) il profilo di tempo cui basale è stato schiacciato da sottrazione il profilo di tempo dall'area scura e/o montaggio tramite una funzione polinomiale. Riprodotto con permesso dalla Royal Society of Chemistry8. (C) l'ampliamento della piazza in (B), vale a dire, la previsione del profilo orario. (D) densità schematica delle intensità dei punti di riferimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: profilo di tempo rappresentativo dell'intensità di segnale dal lampeggio spot e soglia per la definizione di chiari e scuri eventi (linea orizzontale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante distribuzioni di probabilità per lampeggiante macchie complottati contro loro durate. (A) distribuzioni di probabilità per eventi luminosi complottato contro loro durate in un grafico del logaritmo-logaritmo. Linee punteggiate e tinta sono raccordo risultati utilizzando equazioni come Log10Psu(t) = Log10(
) e Psu(t) = , rispettivamente. (B) distribuzioni di probabilità per eventi oscuri complottato contro loro durate in un grafico del logaritmo-logaritmo. Esse possono essere montate come una curva data da una legge di potenza con una funzione esponenziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: istogrammi rappresentativi dei parametri derivati dalla legge di potenza. (A) istogramma di esponenti di legge di potenza per eventi luminosi. (B) istogramma di esponenti di legge di potenza per eventi oscuri. (C) istogramma del troncamento volte a legge di potenza con una funzione esponenziale per gli eventi di scuri. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: film rappresentativo del lampeggiante SERS. Punti lampeggianti multicolore sono osservati da argento nanoaggregati con poli-L-lisina. Questo copre un'area di 50 µm × 40 µm ed è stato scattato con un microscopio invertito accoppiato ad una fotocamera CCD colore attraverso un filtro di passaggio lungo. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Figura S2: rappresentante microscopio elettronico a scansione immagine di nanoaggregati argento costituita dall'aggiunta di poli-L-lisina o NaCl. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S3: spettro Raman convenzionale per thiacarbocyanine polvere e rappresentante spettri SERS temporale ha oscillato da un singolo nanoaggregati argento con thiacarbocyanine. Riprodotto con permesso dalla Royal Society of Chemistry8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Evento | Tempo di inizio/s | Tempo di fine/s | Durata/s |
| scuro | 0.0000 | 3.5476 | 3.5476 |
| luminoso | 3.5476 | 4.0981 | 0.5505 |
| scuro | 4.0981 | 5.8720 | 1.7738 |
| luminoso | 5.8720 | 5.9331 | 0.0612 |
| scuro | 5.9331 | 6.3613 | 0.4282 |
| luminoso | 6.3613 | 6.4836 | 0.1223 |
| scuro | 6.4836 | 6.6671 | 0.1835 |
| luminoso | 6.6671 | 6.7895 | 0.1223 |
| scuro | 6.7895 | 7.0341 | 0.2447 |
| luminoso | 7.0341 | 7.0953 | 0.0612 |
| scuro | 7.0953 | 8.3798 | 1.2845 |
| luminoso | 8.3798 | 8.4409 | 0.0612 |
| scuro | 8.4409 | 8.6856 | 0.2447 |
| luminoso | 8.6856 | 8.7468 | 0.0612 |
| scuro | 8.7468 | 9.6643 | 0.9175 |
| luminoso | 9.6643 | 9.9089 | 0.2447 |
| scuro | 9.9089 | 9.9701 | 0.0612 |
| luminoso | 9.9701 | 10.3371 | 0.3670 |
| scuro | 10.3371 | 10.3983 | 0.0612 |
Tabella 1: tabella rappresentanza di evento scuro o luminoso, ora di inizio, ora di fine e durata dell'evento. Questi sono stati derivati dalla Figura 3.
| Durata/s | Lol dell'evento | Sommatoria | (Summation)/(Duration) | Distribuzione di probabilità/s-1 |
| 0.0612 | 102 | 205 | 3351.5791 | 0.64494 |
| 0.1223 | 41 | 103 | 841.9821 | 0.16202 |
| 0.1835 | 18 | 62 | 337.8828 | 0.06502 |
| 0.2447 | 9 | 44 | 179.8408 | 0.03461 |
| 0.3058 | 4 | 35 | 114.4442 | 0.02202 |
| 0.3670 | 3 | 31 | 84.4707 | 0.01626 |
| 0.4282 | 3 | 28 | 65.3967 | 0.01258 |
| 0.4893 | 4 | 25 | 51.0911 | 0.00983 |
| 0.5505 | 1 | 21 | 38.1481 | 0.00734 |
| 0.6117 | 1 | 20 | 32.6983 | 0.00629 |
| 0.6728 | 5 | 19 | 28.2395 | 0.00543 |
| 0.7340 | 2 | 14 | 19.0740 | 0.00367 |
| 0.9786 | 1 | 12 | 12.2619 | 0.00236 |
| 1.0398 | 1 | 11 | 10.5789 | 0.00204 |
| 1.1621 | 2 | 10 | 8.6048 | 0.00166 |
| 1.3456 | 1 | 8 | 5.9452 | 0.00114 |
| 1.4068 | 1 | 7 | 4.9758 | 0.00096 |
| 1.9573 | 1 | 6 | 3.0655 | 0.00059 |
| 2.0796 | 1 | 5 | 2.4043 | 0,00046 |
| 2.2631 | 1 | 4 | 1.7675 | 0.00034 |
| 2.4466 | 1 | 3 | 1.2262 | 0.00024 |
| 2.8136 | 1 | 2 | 0.7108 | 0.00014 |
| 2.9359 | 1 | 1 | 0.3406 | 0,00007 |
Tabella 2: Tabella rappresentanza della durata, numero di eventi per ogni durata, somma del numero di eventi per la durata più lunga, sommatorie divise per ogni durata e loro distribuzioni di probabilità normalizzate.
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Discussion
Dallo svincolo di nanoaggregati argento, SERS è emessa. Quindi, abbiamo bisogno di preparare nanoaggregati piuttosto che nanoparticelle colloidali, che sono coperti con gli anioni citrato. Aggregati d'argento sono formati dall'effetto creato tramite l'aggiunta di poli-L-lisina, che ha -NH3+ ed è l'origine della SERS, la salatura o cationi Na+ da NaCl, come mostrato in Figura S2 del materiale supplementare. Inoltre, per illuminare i molti punti nella vasta area, il raggio laser unfocused è consegnato ad un angolo di 30° rispetto alla superficie del campione, attraverso una lente che non è collegata al microscopio. C'è una possibilità che la zona di osservazione non è illuminata. Abbiamo regolare e spostare l'area di laser per illuminare l'area di osservazione con elevato ingrandimento. Dopo questa ottimizzazione, macchie di colore monotoni sono visibili nei dintorni dello stesso colore. Queste sono le fasi critiche per lampeggiante osservazione SERS.
Qui, sono discusse questioni che richiedono attenzione per l'analisi di legge di potenza. In primo luogo, la soglia per la definizione di chiari e scuri eventi influenza l'analisi lampeggia. Quando la soglia è aumentata, gli esponenti di legge di potenza e volte di troncamento tendono ad aumentare anche di4,5,9. Quando gli esponenti (αsu e αfuori) e tempi di troncamento mostrano tendenze diverse, la dipendenza della SERS lampeggiante può essere scoperto. In secondo luogo, il più piccolo esponente di legge potenza rappresenta il pendio ripido della linea dato dalla legge di potenza nel grafico del logaritmo logaritmo, che rappresenta la probabilità più bassa di lunga durata per il brillante o scuro evento7. Perché gli eventi brillanti non possono continuare per lunghi periodi, meno punti per gli eventi luminosi vengono tracciate nel grafico rispetto a quelle per gli eventi di scuri. Quindi, i valori αon tendono ad essere più piccolo del αfuori, valori7, a differenza del lampeggio da un singolo QD (αoff = αsu = -1,5)18. In terzo luogo, gli esponenti solo diventano leggermente più grande-110, perché la distribuzione di probabilità è data da:
,
cui numeratore a medio termine (derivato dal protocollo 3.2.5; veda la terza riga della tabella 2) tende a diminuire alle durate più lunghe di t, perché anche il numero di eventi di chiari e scuri per le durate più lunghe tende ad essere diminuita dal fatto che le molecole di muovono in modo casuale e difficilmente possono rimanere in un stato non-emissiva o emissiva (collegamento con il nanoaggregati) per un lungo periodo di tempo, come espresso nella seconda riga della tabella 2. La legge di potenza esponente α = -1,5 o -1, può essere derivato dal fatto che la molecola in modo casuale cammina su una superficie d'argento - o è bidimensionale, rispettivamente4,5,18. Al contrario, si abbrevia il tempo di troncamento di un più veloce molecolare passeggiata aleatoria e/o barriera di energia più alta da un non-emissiva a stato emissivo4,5,19. È notato che le percentuali di eventi cui distribuzione di probabilità non può essere riprodotto da una legge di potenza con una funzione esponenziale sono dati importanti9,10, perché la mancata riproduzione proviene da molto tempo tempi di troncamento.
In precedenti studi12,13,14, la funzione di autocorrelazione è stato anche utilizzata per lampeggiante SERS. La funzione di autocorrelazione, che è stata utilizzata per la spettroscopia di correlazione di fluorescenza, rappresentati i coefficienti di diffusione e le concentrazioni di molecole fluorescenti in movimento dentro e fuori una zona focale21,22. Per lampeggiante SERS, tuttavia, nessuna funzione semplice può riprodurre la funzione di autocorrelazione14. Ciò suggerisce un processo complesso per lampeggiante SERS, perché una funzione di autocorrelazione può identificare alcune periodicità. In un'altra analisi quantitativa, un punteggio di deviazione standard normalizzata è stato derivato da un profilo di tempo del segnale15. Un grande punteggio indicato instabilità in intensità totale. Questi approcci di analisi possono essere adatti per il comportamento di alcune molecole, piuttosto che il comportamento di una singola molecola. Inoltre, la durata media per eventi luminosi sono stata utilizzata per l'analisi del lampeggiante SERS4,14. Questi potrebbe rivelare il comportamento della molecola in un maggiore campo EM, simile per l'imaging di Super-risoluzione di SERS16. Tuttavia, le medie per eventi oscuri non potrebbero essere derivate; vale a dire, la durata totale di eventi oscuri SERS da singolo argento nanoaggregati sono stati diminuiti da un aumento del numero di eventi4, mentre la durata totale della brillante eventi SERS aumenta. Di conseguenza, solo il comportamento molecolare di brillante SERS eventi potrebbe essere studiato con queste tecniche. Utilizzando un'analisi di legge potenza, d'altra parte, il comportamento molecolare per lo stato scuro (vale a dire sulla superficie d'argento, fatta eccezione per giunzioni di nanoaggregati argento) può essere stimato in termini di potenza legge esponente αfuori e troncamento tempo10 . Si tratta di una differenza significativa da tecniche precedenti.
Per confermare che il lampeggio è indotto dalla SERS, lo spettro è misurato dal nanoaggregati argento al centro di una vista attraverso un foro stenopeico, come illustrato nella Figura S3 in materiale supplementare. Tuttavia, non è misurato da tutti i punti lampeggianti7,8,9,10,11. Per poli-L-lisina11, lampeggiante in una zona di grande lunghezza d'onda è attribuita non SERS, ma di superficie-enhanced fluorescenza, che trae origine anche in campi EM avanzate come SERS. Inoltre, è discutibile per collegare gli spettri oscillati con il lampeggiante. Si tratta di una limitazione della tecnica attuale.
In futuro, lampeggiante SERS dovrebbero essere analizzati in termini di ogni picco. Vale a dire l'analisi della potenza di legge dovrebbe combinarsi con formazione immagine spettrale. Utilizzando un bi-analita tecnica17, in cui firme uniche vibrazionale sono osservate da misto analiti, l'origine della singola molecola SERS è stato confermato. Tuttavia, comportamento molecolare non può essere studiato in modo significativo, a causa della risoluzione di tempo. Recentemente, il diverso comportamento di ogni origine è stato rilevato in termini di tempi di troncamento, osservando ognuna delle macchie lampeggiante attraverso ogni filtro ottico e la legge di potenza analisi11.
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Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
L'autore ringrazia il Prof Y. Ozaki (Kwansei Gakuin University) e Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) per la loro proficua discussione su quest'opera. Questo lavoro è stato supportato da KAKENHI (sovvenzione per Scientific Research C) dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (n. 16K 05671).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate, 99.8% | Wako | 194-00832 | |
| Trisodium citrate dihydrate, 99. % | Wako | 191-01785 | |
| Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamine | Hayashibara Biochemical Laboratories | NK-2703 | a kind of thiacyanine dyes |
| 3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt | Hayashibara Biochemical Laboratories | SMP-9 | a kind of thiacarobocyanine dyes |
| Sodium chloride, 99.5% | Wako | 191-01665 | |
| Dimroth condenser | Iwaki | 61-9722-22 | perchased from AS ONE |
| Magnetic stirrer | Corning | DC-420D | |
| Oil bath | Advantech | OS-220 | |
| Glass plate | Matsunami | S-1112 | Microscope slide |
| Blower | Hozan | Z-288 | Air duster |
| Liquid blocker pen | Daido Sangyo | LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-70 | |
| Objective lens | Olympus | LCPlanFl 60× | NA 0.7 |
| Dark field condenser | Olympus | U-DCD | NA 0.8–0.92 |
| Cooled digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-AG | controlled by software Aqua Cosmos |
| Software for the cooled digital CCD camera | Hamamatsu | AquaCosmos | used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video |
| Color CCD camera | ELMO | TNC-C920 | not used for analysis |
| DPSS laser | RGB laser system | NovaPro532-75 | λ = 532 nm; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2) |
| Interference filter | Semrock | LL01-532-12.5 | |
| Long pass filter | Semrock | BLP01-532R-25 | |
| Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events | home-maid | programmed by C++ | |
| Software for the fitting by a power law | LightStone | Origin6.1 |
References
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