Summary
התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.
Abstract
Immunoblotting הפך להיות טכניקה שיגרתי במעבדות רבות עבור חלבון איפיון מ דגימות ביולוגיות. פרוטוקול הבאים מספק אסטרטגיית חלופיים, נימי לגירויי כאב תוך התמקדות (cIEF), עם יתרונות רבים בהשוואה ל- immunoblotting קונבנציונלי. זוהי שיטה נוגדן מבוססי אוטומטית, מהירה, כמותי שבו הליך שלם blotting המערבי מתקיים בתוך נימי ודק במיוחד. טכניקה זו לא דורשים ג'ל כדי להעביר קרום, בנוכחות אחר של שהכלים, או סרטים, אשר נדרשים בדרך כלל עבור immunoblotting קונבנציונלי רנטגן. כאן, החלבונים מופרדים לפי תשלום שלהם (נקודה איזואלקטרית; pI), שימוש פחות microliter (400 nL) סה כ החלבון lysate. לאחר אלקטרופורזה, חלבונים הם ותשמרו על גבי קירות נימי על ידי טיפול אור אולטרה סגול, ואחריו ראשיים ומשניים (חזרת peroxidase (HRP) מצומדת) נוגדן דגירה, שאת איגודו מתגלה דרך משופרת chemiluminescence (ECL), יצירת אות אור שניתן שנתפסו או נרשם על ידי מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). התמונה הדיגיטלי ניתן לנתח, לכמת (אזור הפסגה) באמצעות תוכנה. הליך תפוקה גבוהה יכול להתמודד עם דגימות 96 בכל פעם; היא רגישה מאוד, עם זיהוי חלבון בטווח picogram; מפיק תוצאות מאוד לשחזור בגלל אוטומציה. כל ההיבטים האלה יקרים מאוד, כאשר הכמות של דגימות (למשל, דגימות רקמה, ביופסיות) הוא גורם מגביל. הטכניקה יש יישומים רחב יותר, כולל הקרנה של סמים או נוגדנים, גילוי סמן למטרות אבחון.
Introduction
התמקדות לגירויי כאב נימי (cIEF) היא מתכלה אוטומטיות, המבוססים על נימי הפותר חלבונים על בסיס שלהם תשלום1,2,3. זה מאוד לשחזור ובעל יכולת לפתרון חלבונים ו שלהם איזופורמים ששונה post-translationally במהירות, באופן כמותי. הוא מציג אלטרנטיבה שיטות קונבנציונליות כמו סופג המערבי. בעוד סופג המערבי הוא טוב מאוד עבור המאשרים את נוכחותם של חלבונים בשפע בדגימות נגיש; השתנות זמן הצריכה, כימות מדויק הנוכחי אתגרים, בפרט כאשר בחינת דגימות רקמה ביולוגית. אכן, השתנות זו בעיה פנימית ב סופג המערבי, שכן ישנם שלבים רבים מעורבים, כגון טעינת וריצה של ג'ל מרחביות-דף, העברה של חלבונים על גבי קרום, דגירה עם חומרים כימיים שונים (למשל., יסודי ותיכון נוגדנים, ECL), ופיתוח על גבי סרט צילום רנטגן4. עד מהרה, בטכניקה blotting המערבי משתפרת מימוש הקלטה דיגיטלי של אותות chemiluminescent (מערבונים דיגיטלי) לאחרונה, מערכת אוטומטית blotting המערבי פותחה, כלומר את נימי המערבי, אשר הוא יותר דיבורית ג'ל ללא מערכת. וזמינותו כולה היא אוטומטית לאחר הטעינה של צלחת מדגם (דגימות עם ריאגנטים נחוץ כל) לתוך מערכת3,4. הכלי יבצע את כל השלבים כמו הפרדת חלבונים, קיבעון של חלבונים על גבי קיר נימי, נוגדן incubations, שוטף בין שלבים שונים, ופיתוח כימות של הסימנים chemiluminescent. לפיכך, ההליך cIEF המובאת כאן מספק רזולוציה גבוהה ורגישות.
שיטה זו היא רגישה, ככל אותות יכול להיות שנוצר לכמת מן picograms של חלבונים1. רגישות גבוהה עם הפארמצבטית מעולה עושה את הטכנולוגיה הזו מאוד שימושי עבור ניתוח הקליני דגימות. זה יכול לזהות כמו גם להבחין בין שינוי translational פוסט (למשל, חלבונים phosphorylated שונים איזופורמים) של חלבונים. טכנולוגיה זו שימש בהצלחה לנתח שונים איתות המסלולים4,5 במחקרים קליניים במטרה לפתח הרפוי חדש בסרטן3, והיא בעלת פוטנציאל גדול עבור גילוי התרופות, סמן חלבון .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תא תרבות, גירוי, פירוק
פתק: ניתן להשתמש בשיטה זו עם סוגי תאים רבים. כדי להמחיש את השיטה, מתואר דוגמא באמצעות תאי אנדותל יפתור (HUVECs).
- תרבות HUVECs על מצופים ג'לטין, צלחות פטרי 10 ס מ בינוני הבזליים תא אנדותל עם תוספי המתאים (ראה טבלה של חומרים), ומכילה גם 5% FCS, גורם הגדילה באפידרמיס (5 ng/mL), צמיחה אנדותל כלי הדם (VEGF: 0.5 ng/mL), FGF בסיסי (10 ng/mL), פקטורי גדילה דמויי אינסולין (20 ng/mL), הידרוקורטיזון (0.2 µg/mL), חומצה אסקורבית (1 µg/mL).
- ברעב תאים בין לילה תא אנדותל בינונית הבזליים בתוספת 1% FCS, אין תוספת פקטורי גדילה.
- תשאף כל מדיום, להוסיף 2 מ של תאי אנדותל בינוני תרבות ללא גורמי גדילה (רעב בינוני) מנה אחת (בקרה), ולאחר מכן להוסיף 50 ננוגרם למ"ל VEGF 2 מ של רעב בינוני תרבות בקערה השניה במשך 7 דקות.
- האחות המדיום ולשטוף תאים פי 2 עם טמפרטורת החדר 10 מ"ל PBS.
- ודא צלחות פטרי על הקרח ולשמור אותם שם משלב זה ואילך.
- להוסיף 250-400 µL של קרח פירוק קר מאגר (Bicine/בחורים; ראה טבלה של חומרים) מעכב פרוטאז מימית המכילה תערובת ושילוב מעכב דימתיל סולפוקסיד (מעכבי פוספטאז; ראה טבלה של חומרים) כל צלחת 10 ס מ. מערבולת את הצלחת להבטיח כיסוי הולם ולשמור אותו 10 דקות על קרח.
הערה: הריכוז הסופי של פרוטאז, דימתיל סולפוקסיד מעכב לערבב צריך להיות 1 x. - לגרד את התאים מתוך קערה עם תא במגרדת, העברת לרכבת התחתית microfuge מראש צוננת. פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים כדי lyse תאים.
- בקצרה sonicate התאים ב 4 º C. הגדר את sonicator כדלקמן: מספר מחזורים = 5, כוח = נמוך, = 5 שניות, חופש = 30 s. שלב זה נכלל לשבור חומצות גרעין, ולא על lyse תאים.
הערה: Sonication צריך להיות מתון כדי למנוע דנטורציה של חלבונים. - מערבולת הצינור עבור 5 s (לא ברציפות), 2 s (3 פעמים), ושעה לשמור על הקרח.
- להבהיר lysate על ידי צנטריפוגה ב g x 14,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C, אז מיד להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי microfuge מראש צוננת.
- מודדים את ריכוז חלבון באמצעות ערכת4assay חלבון Bicinchoninic חומצה (BCA).
- להפוך 10 µL aliquots, הצמד להקפיא קרח יבש או חנקן נוזלי, לאחסן ב- 80 ° C עד השימוש.
2. הכנת תערובת הדוגמא (החישוב עבור 150 µL מדגם Mix)
- תחילה, הכן תערובת diluent לדוגמה על-ידי הוספת 1 µL של שילוב מעכב דימתיל סולפוקסיד (במניה 50 x) ו- 2 µL של מעכבי פרוטאז (במניה 25 x) כדי µL 47 של מדגם diluent (ראה טבלה של חומרים), כך הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד מעכבי ו מעכבי פרוטאז הופך 1 x. בשלב הבא, לדלל את lysates חלבון באמצעות השילוב diluent הדגימה כדי להשיג את ריכוזי הרצוי (ראה שלב 2.3).
- להכין מיקס מעכב דימתיל סולפוקסיד/ampholyte/הסולם/פרוטאז מעכב על-ידי הוספת סטנדרטי 3.325 µL סולם (ראה טבלה של חומרים; במניה 60 x), µL 6 של מעכב פרוטאז (25 x), µL 3 של דימתיל סולפוקסיד מעכב (50 x) כדי µL 137.675 ampholyte premix (ראה טבלה של חומרים). מערבולת שפופרת לפחות 15 s, סה כ 5 s במועד (3 - 4 פעמים), לשמור על הקרח.
- לערבב את הפתרונות של שלבים 2.1 ו- 2.2 ביחס 1:3, כך הריכוזים הסופי של דימתיל סולפוקסיד, מעכבי פרוטאז, והסולם pI רגיל להיות 1 X, והושט החלבונים בתוך נימי הריכוזים הסופי הרצוי (למשל, µg 50/mL שומש איור 2).
הערה: ריכוז חלבון נים, ובכן זהים. - לטעון µL 10 של מדגם mix לתוך הבאר המתאים, לפי התוכנית תבנית assay 384-ובכן צלחת (ראה שלב 3 ו- 1 באיור) ולשמור את הצלחת על קרח.
- לדלל הראשי (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, שבערך), נוגדנים משניים (1:300) עם נוגדנים diluent (ראה טבלה של חומרים), פיפטה 10 µL של µL הראשית ו-15 של נוגדנים משניים לבאר כל.
הערה: באופן כללי, ריכוז גבוה יותר של נוגדנים נדרשים עבור מבחני cIEF לעומת שהכלים המערבית המקובלת. - לערבב הלומינול, במה השתמשת XDR (יחס 1:1; ראה טבלה של חומרים) יחד, פיפטה 15 µL כל טוב.
הערה: לערבב טריים פתרונות אלה בכל פעם לפני השימוש ולשמור על קרח. - לאחר כל ריאגנטים ודוגמאות הם pipetted לתוך הצלחת, centrifuge את הצלחת ב 2,500 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי לסובב את הנוזל ולהסיר את הבועות. אם בועות עדיין קיימים, להסיר אותם באופן ידני באמצעות טיפ פיפטה דק.
הערה: אל תטען יותר מ-20 µL של מדגם, או נוגדנים לכל טוב; אחרת, פיפטה כלי לא יכול לרחוץ כראוי. הקפד בצע את ההוראות של היצרן כדי להכין ריאגנטים כל.
3. עיצוב תבנית Assay חדש עם מערכת תוכנה (איור 1)
- פתח את תוכנת המערכת ולחץ "חדש" מתוך תפריט קובץ.
- פתח את החלונית ' פריסה ' ו להקצות מיקומים עבור ריאגנטים ודוגמאות בצלחת-ובכן 384. השתמש למקסימום של בארות 96 לכל צלחת 384-. טוב.
- לעשות משימה מגיב על ידי לחיצה בכל מקום לבאר בבלוק. בחר גוש שורה 12 בארות. וולס, למשל, 1-12 או 13-24, מוקצים כבלוק כברירת מחדל.
- ללכת לבר כלי פריסה חלונית והכנס של בלוק שורה ריקה או מדגם, ראשי, משני, או לחסום שורה הלומינול. כל בלוק מוקצית בצבע שונה, כך הם קל להבדיל.
הערה: בעת לחיצה על הבאר, ניתן לראות גבול שחור מסביב לבלוק בו הבלוק החדש יתווסף בחלונית. ניתן גם למחוק שורה בלוק. - עבור חלונית פרוטוקול ובחר מיקום ריאגנט בצלחת. לאחר מכן, לחץ על תא בעמודה לדוגמה, בחר הכימית מתוך התפריט הנפתח.
- בצורה כזאת אותו, בחר את ריאגנט מיקומים עבור העיקרי, המשני, הלומינול עבור כל מחזור.
- לחץ על התאים, אחד בכל פעם, בעמודה נוגדן ראשית או משנית, ולשנות את הזמנים דגירה, במידת הצורך.
הערה: ערך הערות עבור כל מחזור ניתן גם להוסיף. - להוסיף מחזורים על ידי לחיצה על הלחצן 'הוסף' באזור ' ' פרוטוקול. מחזור 1, 4 מחזורים או כל המחזורים (מקסימום של 8 מחזורים ניתן להוסיף לפרוטוקול).
הערה: זה אפשרי להעתיק ולהדביק מחזור מידע בשלב זה: בחר מחזור, הולכים לערוך, להעתיק ולהדביק. - הזן מידע המתייחס המדגם, כגון הזהות של נוגדנים ראשיים ומשניים, מספרי קטלוג ו דילולים, וכדומה, בחלונית תבנית. זהו שלב אופציונלי זה שימושי במהלך הניתוח שלאחר ריצה.
- שמור את הקובץ assay חדש. לפני לחיצה על לחצן 'התחל', לבדוק במהירות את הפריסה כדי לוודא כי הכל תקין.
4. פרוטוקול cIEF כלי הגדרת
- הגדר נימי לגירויי כאב אלקטרופורזה התמקדות בתנאי ההפרדה. אלה צריכים להיות 15,000 µW ו- 40 דקות, הזמן הנייח UV צריך להיות 80 s. עם זאת, הפעם הנייח UV ניתן להגדיר בטווח של 80-140 s, ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור החלבון עניין.
הערה: נקודת זמן קיבעון UV ניתן להגדיר עבור כל מחזור, אך לא עבור כל נים. - סט לשטוף 1 עד 2 מנקי, 150 s כל שטיפה (ברירת המחדל), נוגדן ראשוני הדגירה במשך 120 דקות.
- סט לשטוף שוטף 2-2, תמורת 150 s כל שטיפה (ברירת המחדל), נוגדנים משניים הדגירה למשך 60 דקות.
- הגדר שטיפת 3, אשר צריך להיות שוטף 2, תמורת 150 s כל לשטוף (ברירת המחדל).
- להגדיר זמני חשיפה מתי יזוהו chemiluminescence; אלה צריך להיות 30, 60, 120, 240, 490 ו- 960 s. כל השלבים (1-8) יבוצע ב נימי יחיד.
5. הפעלת הקובץ Assay
- ברגע שהכל יהיה מוכן, לחץ על התחל כדי להתחיל בהפעלה. התוכנה תנחה אותך כדי להסיר את הפסולת, למלא את המים ואת תיבת נימי, כדי להוסיף המגש משאב, כדי להוסיף מאגר לשטוף anolyte ו- catholyte, ולבסוף לטעון את הצלחת במגש מדגם מקורר.
הערה: הסרת המכסה מהתיבה נימי, אבל אל תסיר את המכסה הצלחת וזמינותו. ניתן להסיר את המכסה מהצלחת באופן אוטומטי על-ידי הכלי בעת הצורך. פעולה זו מסייעת למנוע אידוי מגיב. - כמה דקות לאחר ההפעלה הופעל, שורת המצב המכשיר יוצג על מסך המחשב. ניתן לראות הודעות מצב וברים התקדמות המתאים בשלב הנוכחי של המכשיר.
הערה: בתחילה, המכשיר לבדוק אם הכל תקין לפני הליך pipette את anolyte ואת catholyte במגש ההפרדה, איסוף הרחוב הראשון של נימים 12, להסיר את המכסה של הצלחת והצבת דגימות מן המדגם צלחת לתוך הנימים, ואז סוף סוף אל החדר ההפרדה עבור אלקטרופורזה. - לחץ על המסך סיכום לרוץ לראות שתי חלוניות: מצב והפרדה. משתמשים יכולים להציג את התקדמות הפעלה, ניתן לאחסן סרטים ההפרדה (הנימים 12 בכל מחזור) השלמת השלב אלקטרופורזה של כל מחזור. לצפות את ההפרדה אלקטרופורזה במחזה נימי, הסרט ההפרדה לקפילר הזה על ידי לחיצה על מחזור הרצוי, ולאחר מכן על לחצן ההפעלה שבלוח הבקרה.
- ניתן לאחסן את קובץ ההפעלה באופן אוטומטי בעת סיום המרוץ.
6. לנתח את הנתונים (איור S1)
- פתח את קובץ ההפעלה, בחר בכרטיסיה מסך ניתוח. איור S1A, הוא הנתונים (פסגות) בגרף דגימה מן נימי שנבחר (קרי, נימיה 4 של מחזור 1).
- לחץ על עריכה ולאחר מכן ניתוח (איור S1B). בשלב זה, משתמשים יכולים לשנות את טווח pI להחיל תקן pI מתאים עבור ניסוי מסוים, להוסיף התאמה שיא, להוסיף שם שיא.
הערה: כאשר premix באמצעות ampholyte pH 5-8 (כמו המקרה כאן), הסולם הסטנדרטי המומלץ לשימוש הוא אחד עם פפטידים fluorescently שכותרתו עם pIs של 4.9, 6.0, 6.4, 7.0, 7.3, בעת שימוש pH 3-10 premix, הסולם המומלץ הוא אחד עם pIs של 4.0 , 4.9, 6.0, 6.4 ו- 7.3. 2 - התוצאות מוצגות בכרטיסיה פסגות; הערכים המוצגים על הדגימות הן עמדה, pI, שיא הגובה, אזור, % באזור, שיא רוחב ו אות רעש (S/N) (דמות S1C). בחר אילו נתונים לשימוש, לייצא את הנתונים לצורך ניתוח נוסף.
הערה: הנתונים בלבד ניתן לייצא לאחר תיוג הפסגה (איור S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עיצוב של assay חדש: פריסה של צלחת assay מוצג איור 1A. מקסימאלית, ניתן להשתמש בארות 96 מהצלחת 384-טוב בבלוקים של בארות 12 עבור כל תנאי (נוגדן). כל בלוק של בארות 12 יכול להתחיל A1-A12 או A13-A24. צבע מקודד שורות לאפשר אחד להבחין בין דוגמאות או ריאגנטים אחד מהשני. בתבנית assay (איור 1B), מידע רלוונטי על כך assay מסוים ניתן לאחסן, אשר יכול לשמש בשלבים מאוחרים יותר של ניתוח התוצאות. איור 1C מציגה את הסיכום של הפרוטוקול.
זיהוי של חלבון phosphorylated ו- unphosphorylated חוץ-תאית מוסדר קינאז (pERK1/2, ERK1/2) HUVEC lysate גירוי עם VEGF: באופן כללי, פוסט חלבונים translationally שונה, כגון phosphoproteins, הם קשה לזהות בגלל הכמות הנמוכה שלהם אופי חולף, ואת חוסר נוגדנים ספציפיים. גירוי אנדותל פקטורי גדילה (VEGF) כלי הדם בעקבות הרעבה סרום הפעלת קולטן טירוזין קינאז (VEGFR2) אשר מוביל להפעלת מסלול MAPK ותוצאות טיפשה זירחון. לניסויים באמצעות HUVECs, lysates מתאי מגורה עם או בלי VEGF במשך 7 דקות יכול לשמש, כמוצג באיור2. איור 2A מציגה את electropherogram של pERK1/2 מ ± lysates מגורה-VEGF. ברור, עם VEGF יש אינדוקציה גבוהה מאוד של חלבונים phosphorylated (פסגות במסגרת אדומה). שיבוץ מראה הפקד הטעינה אנדוגני HSP 70 (איור 2 א הזחה), המציינת את הטעינה דומה של דוגמאות לדגימות אינו מטופל ומטופל. Immunoblot קונבנציונלי (איור 2Cפאנל שמאלי) היו רק שתי להקות זוהה (phosphoERK1; pERK1, pERK2). עם זאת, pERK1/2 חלבונים שנפתרו לתוך פסגות 4 ppERK2, pERK2, ppERK1, pERK1 על ידי ניתוח cIEF (איור 2 א). באופן דומה, איור 2B מציגה את electropherogram של ERK1/2 מ ± lysates מגורה-VEGF. שיבוץ מראה באותו פקד הטעינה להשתמש במקביל. רק שני immunoblot המקובלת הופעות להקות המתאים ERK1, ERK2 (איור 2Cלוח נכון) ואילו עם cIEF, pERK1/ERK2 נפתרה לתוך פסגות 6 (איור 2B) המתאים שונה כל 4 phosphorylated פסגות, פסגות unphosphorylated 2, ERK1 ו- ERK2. זה מדגים את אחד היתרונות עם cIEF, כלומר איזופורמים חלבון זה יכול להיות נפתרה העריך איכותית והן באופן כמותי. בנוסף, אפשרי לקבל מידע כמותי של איזופורמים phosphorylated מן נוגדן למזהים ייחודיים של חלבון הליבה, יותר מאשר את השינוי posttranslational.
איור 1 : עיצוב של פריסת צלחת assay בתוכנה. הגדרת המיקום של ריאגנטים כל פריסה של 384-ובכן צלחת (A). מקודדים 12 שורות טוב המציג את המיקום עבור דגימות, נוגדנים ריאגנטים chemiluminescent. (B) וזמינותו תבנית מציג מידע רלוונטי עם טוב בודדים. פרוטוקול (C) מציג את כל המידע הרלוונטי עבור מחזור 1 ו- 2. במחזור 1 (12 נימים כמוצג בתיבה צבעוניים), המכשיר לוקח דגימה מ A1 (בארות מ A1-A12) ואחריה נוגדן ראשוני B1 נוגדנים משניים (וולס מ B1-B12), מ- D1 (וולס מ- D1-D12), ואת סוף סוף luminol:peroxide XDR מ J1 (בארות מ J1-J12). ב ה-2מחזור, הכל זהה המחזור הראשון, אלא שצריך נוגדן ראשוני של C1 (בארות של C1-C12). איור זה השתנה עם הרשאה. ואח 2015 אספינל-O'Dea2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : זיהוי של חלבונים Mitogen-Activated קינאז (טיפשה 1/2) phosphorylated, סך cIEF assay, immunoblot מסורתיים assay. (א) Electropherogram נציג pERK1/2, חלבונים ב- HUVECs שטופלו ±VEGFA ואחריו cIEF assay, שנבדק על נוגדנים pERK1/2. כחול (unstimulated) קו, קו אדום (ממריצים). פסגות להראות את איזופורמים הטבה/2 בצורה שונה phosphorylated מופרדים על בסיס נקודות לגירויי כאב שלהם. שיבוץ מראה הפקד אנדוגני HSP70 לפעול במקביל עם אותו הדבר lysate. (B) נציג electropherogram מציג ERK1/2 ± מגורה-VEGFA lysate. שיבוץ מראה הפקד אנדוגני HSP70 הפועלות במקביל. עבור electropherogram, שימשו 50 ריכוז lysate µg/mL, שזה שקול ל- 20 ng של חלבונים סה ב- נימי. (ג) immunoblotting המקובלת עבור pERK1/2, ERK1/2 חלבונים ב- ±VEGFA (50 ng/mL) מגורה HUVEC תא lysate. 10 µg מכלל lysate בנתיב שימש immunoblotting. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה S1 איור: שלבי ניתוח התוצאות
(A) להציג את התוצאות של נים עניין. (B) ערוך/הוסף פרמטרים שונים בקובץ וזמינותו. (ג) ניתן להוסיף שמות פסגת הפסגות לפני ייצוא הנתונים לניתוח נוסף. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רגישות ורזולוציה של חלבונים מכריעים לחקר פרוטיאומיה מבנית דגימות ביולוגיות. יש ערך רב להיות מסוגלים לזהות חלבונים אשר נמצאים בכמויות דקה בתאים. cIEF יכולים להציע שיפור רגישות ורזולוציה לאיתור חלבונים ושלהם איזופורמים4.
טכנולוגיה זו שימש בהצלחה ב רבים פרוטיאומיה מבנית המחקר דוחות5,6,7. עדיין, מספר מגבלות הם קשורים, כגון העובדה כי לא כל נוגדנים הראשי יכול לתת אות גם אם הם עובדים יפה immunoblots המקובלת. יש, עדיין, שום רשימה של נוגדנים המאומת שמוצג נכד cIEF, מאז בטכניקה זו הוא די חדש. לבסוף, המכשיר לא יכול להתמודד עם דוגמאות 12 פחות או יותר מ 96 דגימות בכל פעם.
cIEF היא טכניקה חלופית עבור immunoblotting קונבנציונלי, אבל זה לא רשאי לתת תוצאות זהות. cIEF הוכח להיות בהרבה על-קונבנציונאלי immunoblotting מבחינת רגישות ורזולוציה. יתר על כן, cIEF הוא תפוקה גבוהה, חזקה, אוטומטית, robotized, והוא מאוד רגיש, מניב אותות מתאי פחות מ- 25 בהתאם החלבון ניתח1. זה כמותיים מאוד לשחזור, כמו טיפול הוא ממוזער. זיהוי איזופורמים שונים חלבון בגדלים דומים יכולה להיפתר בקלות. לפיכך, הנוגדן באותו יכול לתת מידע כמותי בטפסים חלבון phosphorylated, unphosphorylated מן nanogram כמויות לדוגמה4. למרות immunoblot הקונבנציונלית והן cIEF להסתמך על נוגדן מבוסס זיהוי chemiluminescent, ישנם כמה הבדלים חשובים, כגון immunoblotting המקובלת, החלבונים מופרדים על בסיס משקל מולקולרי שלהם ואילו ב- cIEF, ההפרדה מבוססת על החיוב חלבון. לבסוף, חלבונים יש הם שפגע בסימני ב- immunoblot, ואילו הם נשמרים במצב מקורי שלהם ב- cIEF. הנקודה האחרונה היא הסיבה הנוגדן אותו עשוי או עלול שלא לפעול בשתי השיטות.
מחקרים שונים הראו היישום של cIEF ללמוד זירחון חלבונים מן האדם דגימות החולה3,4,דגימות סרטן המעי הגס האנושי8, העכבר גידול רקמות9או שורות תאים שונים 10. אימוץ של שיטה זו יכולים לקדם את התקדמות מהירה במחקר פרוטיאומיה מבנית בתחומים רבים כגון גילוי תרופות, למטרות אבחון, גילוי סמנים ביולוגיים, איתות מחקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר יש אין גילויים.
Acknowledgments
המחבר תודה פרופסור לנה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה, שוודיה לתמיכה שלה לפיתוח הפרויקט. בנוסף, המחבר תודה רוס סמית, לינה Claesson-ולש, אוניברסיטת אופסלה קריאה ביקורתית, הצעות לשיפור כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
