Summary
在这里, 我们提出一个评估肽对支气管上皮细胞迁移的影响的协议。这种方法允许快速和高度重复获取的数量数据的速度的细胞迁移和伤口闭合。
Abstract
这项工作的目的是显示一种新的方法来评估一些免疫调节分子, 如抗菌肽 (安培) 的能力, 以刺激细胞迁移。重要的是, 细胞迁移是创伤愈合过程中的速率限制事件, 重建损伤后组织层的完整性和正常功能。这种方法的优势, 在经典的化验, 这是基于一个手工制造的从头在细胞单层, 是使用特殊的硅胶文化插入提供两个舱室, 以创建一个无细胞的伪伤口领域, 有明确的宽度 (500 微米).此外, 由于一个自动化的图像分析平台, 有可能迅速获得定量数据的伤口闭合和细胞迁移的速度。更确切地说, 两个蛙皮放大器对支气管上皮细胞迁移的影响将显示出来。此外, 预处理这些细胞与特定抑制剂将提供信息的分子机制的基础上, 这些事件。
Introduction
众所周知, 动物创面愈合是重建损伤后组织层完整性和正常功能的一个基本过程1。尽管暴露于外部环境的上皮表面 (例如,皮肤、呼吸道和胃肠道) 构成了对物理和化学侮辱的保护性屏障, 但伤口的形成很容易发生, 特别是在手术或微生物感染2。例如, 由机会性细菌病原体 (特别是囊性纤维化) (CF) 引起的肺组织的殖民化, 导致呼吸道上皮损害, 从而造成呼吸衰竭3, 4。伤口愈合是一个复杂的主机修复机制, 恢复正常结构的受伤组织5。它的特点是初始炎症, 其次是再生期, 包括上皮, 血管生成和组织重塑与胶原蛋白生产和细胞分化6,7,8.为确保上皮完整性和控制微生物增殖, 所有生物体都产生防御分子, 包括抗菌肽 (安培)9,10。创伤愈合过程是非常困难的模拟在体外由于缺乏细胞碎片和复杂的相互作用在不同的细胞类型之间。然而, 肽的体外能力通过刺激上皮细胞的迁移来加速闭合假伤口, 这表明它有能力愈合受损的上皮。事实上, 细胞迁移是创伤愈合中的速率限制事件, 研究影响细胞迁移的因素将有助于改善伤口愈合的靶向治疗。
在此基础上, 提出了一种高度可重现性的实验检测方法, 它是基于特殊的硅胶培养插入来评估细胞迁移的体外。它是建立在一个500微米的缺口 (伪伤口) 的汇合细胞单层。在人工 "受伤" 领域边缘的细胞将开始迁移到无细胞区, 形成新的细胞细胞接触。文化插入代表了一个新的工具, 快速伤口愈合实验。提供两个由500微米壁隔开的储层, 它们可以适当地放置在3厘米厚的盘子里, 或者放在12井板的井中。将插入的每个隔间填满一个细胞悬浮, 允许细胞在每个指定区域内生长直至汇合, 而除去插入物将产生一个干净的无细胞间隙, 约500微米 (与隔离墙相同的宽度)。一个适当的细胞培养培养基, 辅以测试化合物, 然后可以添加到盘子里/好。然后, 在倒置显微镜下, 可以在不同的时间间隔内可视化间隙闭合, 最好是配备有摄像机进行图像采集。最后, 通过基于 web 的自动图像分析程序测量细胞覆盖区域的变化, 可以量化伤口闭合和细胞迁移的速度。总的来说, 这种方法是一个向前迈进的经典化验, 其中一个划痕是手动切割汇合细胞单膜与无菌针或吸管提示11。事实上, 最后的程序可以摧毁盘子的塑料底部/井和表面涂层, 造成皱纹。此外, "受伤" 区域没有一个明确的宽度沿整个长度的差距, 因为这高度取决于研究人员的压力, 对针/尖。此外, 脱落的细胞可以形成团簇的活和死细胞在边缘的划痕;此外, 将活细胞扩散到 "受伤" 区域可能会干扰细胞迁移速度, 产生不可重现的结果12。
此外, 由于一个划痕图像分析平台, 用户可以迅速收到 (几分钟内) 的数量数据的迁移行为的选定细胞, 而不需要获得额外的软件。该平台能够分析低 (~ 5 x)、中等 (~ 10 x) 和高 (~ 20 x) 放大倍数的相位对比显微镜图像。上传图像的 zip 文件后 (在 * 中. jpg, *. jp2, *. png, *. tiff 格式) 将自动进行分析, 以生成一个摘要文件, 显示单元格覆盖区域和划痕区域的百分比, 以及单元格的速度迁移, 在不同的时间间隔。
在这项工作中, 通过使用青蛙皮肤安培导数,即esc (1-21) 和它的 diastereomer esc (1-21)-1 c13, 和一个支气管细胞线表达功能 CF 跨膜电导调节器 (CFTR)14,15,以多肽诱导的细胞迁移为例, 与未处理的 (对照) 样品进行比较。注意, 气道上皮和 CFTR 在维持肺功能和伤口修复方面起着至关重要的作用16。此外, 通过选择性抑制剂 (例如, AG1478), 表皮生长因子受体 (EGFR) 的17 , 证据表明, 上述肽诱导的支气管细胞迁移涉及激活 EGFR12,报告了18 。
总之, 这个过程的目的是显示如何使用这种硅胶培养插入物代表一个快速和容易接近的检测, 以准确地确定黏附分子的迁移 (例如,支气管上皮细胞) 和控制此类事件的机制。
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Protocol
1. 细胞制剂
- 种子 2.5x106细胞在10毫升的最低基本培养基 (内存) 补充2毫米谷氨酰胺 (MEMg), 加上10% 胎牛血清 (血清), 抗生素 (0.1 毫克/毫升青霉素和链霉素), 和嘌呤霉素 (0.5 µg/毫升的选择和维护细胞线) 在一个 T75 瓶。将烧瓶在37摄氏度和 5% CO2孵化2天。在开始实验之前, 检查细胞在倒置显微镜下的汇合。
注: 用于实验的细胞是永生化的人支气管上皮细胞转基因与慢病毒载体的载体, 赋予嘌呤霉素抗性。他们稳定地表达功能 CFTR14,15。 - 一旦细胞的汇合达到 90-100%, 从烧瓶中吸取培养基, 并将其丢弃在生物安全柜 ii 类的废物瓶中。用6毫升磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞, 不含钙和镁。手动摇动烧瓶并丢弃。
注意: 小心不要用吸管接触细胞单层。 - 添加10毫升的37摄氏度和 5% CO2的烧瓶和孵化的瓶, 10 分钟。
- 把它吸掉, 然后扔掉它。然后在烧瓶中加入2毫升的胰蛋白酶/EDTA。
- 轻轻地摇动烧瓶, 允许溶液完全涂上细胞, 在37摄氏度和 5% CO2上孵化出的烧瓶10分钟, 直到细胞在显微镜下可见分离。
注: 在孵化时间结束时, 细胞应呈圆形, 不附着在塑料表面。如果细胞没有很好的分离, 人工搅拌可能是必要的。 - 加入10毫升的 MEMg 加10% 的血清, 以灭活胰蛋白酶, 并通过洗涤烧瓶的底部收集细胞。将体积转换成锥形50毫升管。
- 在 80 x g上离心管5分钟。
- 在6毫升的 MEMg 加10% 的血清中, 吸入上清并重新悬浮细胞。用吸管反复分解任何团簇。
- 用微取出10µL 细胞悬浮液, 并在先前放在 Burker 或 Neubauer 室的盖玻璃下注入体积。
- 计算单元格数。
2. 细胞播种在文化插入
- 在12井板的每一个井, 转移文化插入与无菌镊子 (图 1)。使用镊子按下插入边, 以便将它们固定在板材的表面。
注: 插入有一个粘性的底部, 允许粘合。
图 1: 硅树脂培养基的示意图表示, 正确放入12井板的井中.请单击此处查看此图的较大版本.
- 适当稀释 MEMg 中的细胞悬浮液加10% 的血清。用70µL 细胞悬架 (大约 3.5x104细胞/室) 填充插入物的每个隔间。
注意: 每个隔间中应用的细胞密度取决于细胞的类型。建议使用一个细胞密度, 导致24小时内完全汇合。 - 在显微镜下, 检查细胞是否从插入隔间漏出, 并在37摄氏度和 5% CO2上孵化12井板24小时。
3. 伪创伤愈合试验
- 孵化后, 在倒置显微镜下对细胞进行可视化, 以验证是否形成了汇合细胞膜。
- 在1毫升的 MEMg 中重新挂起测试化合物 (例如,安培)。
注: 准备新鲜安培稀释从库存解决方案存储在-20 °c。 - 用无菌镊子轻轻取出刀片。小心不要打破细胞膜。将插入物转移到吸水性纸上。
注: 要重新使用相同的刀片, 在70% 乙醇消毒, 至少3小时。建议以后把它们扔掉。 - 要去除非黏附的细胞, 增加1毫升 MEMg 每井使用微。关上盘子, 轻轻地摇动它。
注: 请勿直接在细胞膜上添加培养基, 以避免其破裂。 - 吸入培养基, 并用1毫升 MEMg。关闭板和可视化的无细胞间隙 (由插入创建) 下倒置显微镜下4X 放大, 配备了一个视频摄像头。获取图像的时间为零 (T0), 并将其保存为. jpg 格式。
- 从水井中取出介质, 用1毫升的 PBS 冲洗, 然后丢弃。
- 将测试化合物 (3.2 点准备) 添加到油井中。对于未经处理的对照样品, 添加1毫升的 MEMg。在37摄氏度和 5% CO2上孵化板材。
- 15、20、24小时治疗后, 观察显微镜下的细胞迁移4X 倍放大, 获取图像。
注意: 在此步骤中, 尝试在与 T0 相同的区域中捕获图像。捕捉图像的时间间隔的选择取决于细胞迁移速度。 - 为了研究某些选择性抑制剂的影响,即AG1478 在细胞迁移过程中, 在移除插入物之前从每个插入间隔中吸入介质。
- 用新鲜的 MEMg 清洗每个车厢, 并用70µL MEMg 补充 AG1478。
- 在37°c 和 5% CO2的孵化30分钟后, 按照从点3.3 的说明进行操作。
注: 在洗涤步骤和前处理的细胞膜与特定抑制剂, 小心不要删除插入。
4. 图像分析
- 实验完成后, 选择各种实验组最具代表性的样本, 并在 T0、T15、T20 和 T24 h 上创建一个包含单个图像的 zip 文件。
注意: 在选定的时间间隔内为所有样本拍摄单个图像。运行 triplicates 为每个实验, 这是重复至少三次。最后, 对所有实验组, 分析了每一个时间点的至少3张图像 ("a"、"b"、"c"、等等, 分别从每个独立实验中推导出来)。 - 将 zip 文件上载到图像分析软件中, 通过电子邮件自动提供电子表格摘要文件, 其中包含所选时间点上的单元格覆盖和划痕区域的实验数据 (百分比)。
注意: 对前缘和间隙区域的识别主要是基于边缘检测方法 (旨在识别图像亮度急剧变化的点)。 - 保存数据并收集它们。在时间零处正常化所有数据的平均值。计算每个时间点上所有复制的规范化数据的平均值和相对标准误差 (SEM)。通过对方差进行双向分析, 用适当的统计软件进行统计分析。不同时间间隔的肽治疗组和对照组之间的差异被认为是对p< 0.05 的统计 significant。
- 将获得的数据绘制为一个直方图, 该图显示所有样本组的单元格覆盖区域的百分比 ( vs选定的时间间隔)。
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Representative Results
本协议用于确定1-21 和 esc (1-21)-1 c 在表达功能 CFTR 的支气管上皮细胞的细胞迁移活动中的创面愈合效果。在这项试验中, 将培养物插入12井板的井中, 每个隔间都有3.5万个细胞 MEMg, 辅以10% 的血清。细胞在24小时之内到达了完全汇合, 然后产生了500微米的缝隙, 每个井都充满了含有不同浓度肽的 MEMg。实验重复了四次。如图 2所示, 在细胞单层中产生的伪伤口场几乎完全闭合是由 20 h 内的两个肽引起的, 在1微米和10微米的最佳浓度下, 分别为 esc (1-21)-1 c 和 esc (1-21)。这表明, Esc (1-21)-1 c 更有效地促进在支气管细胞上皮的伪创伤。
图 2: esculentin-1a 衍生安培对支气管上皮细胞单层形成的伪创伤闭合的影响.细胞在硅胶培养插入物的每个隔间被播种, 并且, 在它去除以后, 细胞被拍照为证据细胞迁移 15, 20 和 24 h 在加法肽以后。与未处理的控制单元 (Ctrl) 相比, 计算出每个时间点的细胞覆盖区域的百分比, 并在 y 轴上报告。所有的数据都是从四独立实验中得到的, 从以前的研究14中得到的。控制和处理样品之间测试的统计意义级别为: *p< 0.05、**p< 0.01、***p< 0.001 和 ***p< 0.0001。本文还报道了在1微米浓度下, 每种肽的细胞处理后 (T0) 和20小时前有代表性结果的显微照片。请单击此处查看此图的较大版本.
为了验证 egfr 的活化作用是否在 Esc 诱导的伤口闭合中起作用, 支气管细胞被 preincubated 30 分钟, 5 微米 AG1478, 一个 EGFR 的选择性抑制剂, 在插入去除前。由于细胞覆盖面积的百分比在所有时间间隔内明显减少, 而与在细胞未预处理抑制剂前肽管理 (图 3) 时发现的结果相比, 这指出肽诱导细胞迁移涉及激活 EGFR。然而, 需要进一步研究以澄清由金属蛋白酶介导的 Esc 肽 (例如, 直接 EGFR 活化或反式活化) 触发的分子事件, 这些活动已被显示为对膜锚定的 EGFR 配体进行劈裂.19)。
图 3: AG1478 抑制剂对多肽诱导的支气管上皮细胞迁移的影响.在插入去除之前, 细胞被预先孵化了与5微米 AG1478 为30分钟, 并且随后用肽单独对待在同一浓度。所有的数据都是从四独立实验的手段, 从我们以前的工作14。所示组样本间测试的统计意义级别为: *p< 0.05;p< 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
细胞迁移是许多生理和病理事件中必不可少的过程, 包括伤口愈合、胚胎发育和肿瘤转移。研究细胞迁移的基本过程体外涉及: (一) 建立细胞单层, (ii) 在细胞的汇合层内产生伪伤口, (iii) 在达到伤口闭合之前, 在不同时间间隔捕获图像。, 并 (iv) 对图像序列进行分析, 以量化所选细胞的迁移速度。
研究结果表明, 培养基的应用是定量评价细胞迁移特性的客观可靠的实验技术。这项化验可以由任何研究小组进行, 基本的实验室设备。但是, 应考虑到议定书的一些关键步骤, 以实现重现性。例如, 通过试验确定每个车厢内种子的确切数量, 以便在所有个体样本中获得相同的汇合度是很重要的。为了达到这个目的, 在播种之前, 有一个同步循环阶段的细胞和避免细胞团簇是至关重要的。一种减少结块的可能方法是通过注射器针轻轻地通过细胞悬浮。然而, 增加样本量将大大有助于减少细胞间的变异性。
此外, 在所有样本中创建一个有良好定义宽度的缺口是至关重要的。为此, 不应重复使用硅胶插入两次以上。此外, 应避免在硅树脂分离壁下的细胞生长。为防止这一问题, 软压上的插入, 一旦放入碟板/井, 可以手动应用的手段, 不育镊子, 以增加附着力的插入到塑料。小心去除插入物也会阻碍细胞表面的扩大, 并破坏细胞单层。
然而, 一旦插入正确脱落, 一个伪伤口是完美的生产, 一些细胞线可以从塑料表面分离, 特别是如果他们在没有血清或补充, 如维生素, 氨基酸和生长因子的媒体孵化。细胞培养基中缺乏这些因素, 可以由它们干扰试验化合物的伤口愈合促进活性的事实来决定。为规避这一问题, 强烈建议合理选择培养基成分。
在建立这个伤口愈合过程之前要考虑的另一个关键步骤是不同细胞类型之间存在的不同的迁移速度。此外, 在这种情况下, 需要安排初步实验, 以确定需要捕捉图像的正确时间间隔。还有必要考虑, 与此方法相关的一个限制是, 这种区域性插入不能用于研究悬浮生长的细胞的迁移 (例如,中性粒细胞)。
尽管用硅胶培养刀片进行的伤口愈合化验比传统的划痕试验更昂贵, 但它们允许快速准确地复制细胞迁移活动的数据。重要的是, 一旦系统建立起来, 它可以被用来扩大知识的分子机制的基础上的伤口愈合活动刺激的内生或外源因素。为此, 在制造伪创伤前, 可以进行细胞单分子膜的预处理 (如: 例如,抑制剂)。以 (i.) 细胞增殖阻滞剂丝裂霉素 C 对细胞进行预处理, 探讨由细胞分裂率20或 (ii.) 金属蛋白酶抑制剂是否影响安培引起的 "受伤" 领域的闭合, 以验证金属蛋白酶在激活 EGFR 介导的信号通路方面的贡献 12.
重要的是, 在伤口闭合过程中, 样品可以固定和处理适当的污渍, 细胞骨架和核检测 (罗丹明和 DAPI, 分别), 以可视化的变化, 细胞形态学方面 (例如,通过荧光/共聚焦显微术在前边缘形成 lamellipodia。此外, 在细胞迁移活动开始的时候, 用荧光标记的安培处理电池可以使其细胞分布 (膜表面或细胞内/包涵定位) 在不同时间内可视化。此外, 这些插入物可用于分析极化和分化上皮细胞的伤口愈合活动 (例如, 在空气液界面维持的主要支气管细胞), 后放置在适当的 transwell透水支架。
总之, 所描述的方法有很大的潜力, 大大提高对不同类型的黏附动物细胞/上皮组织的迁移特征的理解, 以及对最有希望的伤口愈合的选择促进剂和/或抑制剂, 在短时间内和高精度。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项工作得到了 Sapienza 大学和意大利囊性纤维化研究基金会 (来自锡耶纳、Sondrio Valchiavenna、蜡样 Il Sorriso di 和帕维亚) 的 FFC#11/2014 代表团的资助。这项工作的一部分也得到了 FILAS 授权 FILAS-RU-2014-1020 的支持。
我们感谢费雷拉博士 (U.O.C. Genetica, 无依儿童 Giannina Gaslini, 意大利 Genova) 提供支气管上皮细胞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
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