Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila
Summary
Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.
Abstract
Consumo de alimentos está sob o controle apertado do cérebro, que integra o estado fisiológico, palatabilidade e conteúdo nutricional dos alimentos e questões de comandos para iniciar ou parar a alimentação. Decifrando os processos subjacentes a tomada de decisão oportuna e moderada alimentação traz implicações importantes em nossa compreensão de distúrbios fisiológicos e psicológicos relacionados ao controle de alimentação. Métodos quantitativos, simples e robustos são necessários para mensurar a ingestão de alimentos de animais após manipulação experimental, como à força, aumentando as atividades de certos neurônios do alvo. Aqui, nós introduzimos a ensaios de alimentação corante-rotulagem-based para facilitar o estudo neurogenetic de controle de alimentação em adultos de moscas de fruta. Podemos rever ensaios de alimentação disponíveis e em seguida descrever nossos métodos passo a passo da configuração para análise, que combinam thermogenetic e manipulação de optogenetic de neurônios controlando alimentação motivação com ensaio de ingestão de alimentos tingir-etiquetados. Também discutimos as vantagens e limitações dos nossos métodos, em comparação com outros ensaios de alimentação, para ajudar os leitores a escolher um ensaio apropriado.
Introduction
Quantificar a quantidade de comida ingerida é importante para avaliar vários aspectos da alimentação controles pelo cérebro em responder às necessidades internas (tais como Estados de fome) e fatores externos (como a qualidade dos alimentos e palatabilidade)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. nos últimos anos, os esforços de decifrar os substratos neurais de controle de alimentação em Drosophila levam ao desenvolvimento de vários ensaios para diretamente a quantificar a quantidade de comida ingerida ou servir como um indicador de alimentação motivação 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
O ensaio de alimentador capilar (CAFE)12,13 foi desenvolvido para medir a quantidade de consumo de alimentos líquidos em uma conta de vidro. O ensaio CAFE é altamente sensível e reprodutível17 e simplifica a medição do consumo de alimentos, especialmente para quantificação de alimentação a longo prazo18. No entanto, este ensaio requer as moscas para subir até a ponta da conta e alimentar de ponta-cabeça, que não é adequado para todas as estirpes. Além disso, porque as moscas a ser testado usando o ensaio de café têm de ser criados no alimento líquido, o efeito destas condições no status de metabolismo ou desnutrição a potencial de criação permanece ser determinado.
O ensaio de Proboscis extensão resposta (PER)11,14 conta a frequência de respostas de extensão narigudo em direção a toques suaves de gotas de comida. POR ensaio provado-se como uma excelente maneira de avaliar alimentação motivação de mosca individual e bundas a influência de palatabilidade e conteúdo de alimentos18,19. No entanto, não é uma quantificação directa da quantidade de ingestão.
Recentemente, foi desenvolvido um método semiautomático, manual do ensaio (MAFE)15, de alimentação. Em MAFE, uma única mosca imobilizada é alimentada manualmente com uma conta que contém o alimento. Dado que as respostas de extensão de narigudo e consumo de alimentos podem ser monitorados simultaneamente, MAFE é adequado para avaliar valores de nutrientes e os efeitos da manipulação farmacológica. No entanto, imobilizando uma mosca pode afetar negativamente seu desempenho comportamental, incluindo a alimentação.
Além disso, voar Proboscis e atividade Detector (FlyPAD)10 foi desenvolvido para quantificar automaticamente o comportamento alimentar. Usando métodos de visão de máquina, FlyPAD registros de interações físicas entre uma mosca e comida para quantificar a frequência e duração das extensões de tromba como um indicador de alimentação motivação. FlyPAD fornece uma abordagem de alto rendimento para monitorar os comportamentos de alimentação de uma mosca em movimento livre, embora a sensibilidade e a robustez deste sistema continua a ser confirmada por mais de12estudos.
Estratégias de rotulagem são frequentemente usadas para estimar a ingestão de alimentos em moscas. É comum de rotular os alimentos com traçadores químicos e, após a alimentação, medir a quantidade de traçador ingerido para calcular a quantidade de ingestão de alimentos. Traçadores radioativos,16,17,20,21,22,23,24,25 permitir a detecção através da cutícula sem homogeneização das moscas. Este método fornece notavelmente baixa variabilidade e alta sensibilidade18e é viável para o estudo de longo prazo da ingestão de alimentos. No entanto, a disponibilidade de radioisótopos utilizáveis e diferentes taxas de absorção e excreção devem ser tida em conta quando se trabalha com este ensaio.
Rotulagem e rastreamento de ingestão de alimentos com cores de alimentos tóxicos é um mais simples e mais segura alternativa2,3,26,,27,28. Moscas são homogeneizadas após a alimentação com alimentos que contenham corantes solúveis e não absorvível, e a quantidade do corante ingerido mais tarde é quantificada utilizando um espectrofotômetro3,24,28,29 . A estratégia de rotulagem é fácil de executar e fornece alta eficiência, mas com uma ressalva. O volume de ingestão de alimentos, estimado a partir da tintura ingerida é menor que o volume real porque excreção começa tão cedo quanto 15 min depois moscas Iniciar alimentação17. Além disso, o ensaio avalia a ingestão de comida tipicamente dentro de um período de 60 min, que só é adequado para investigação do comportamento alimentar a curto prazo24,28. Além disso, vários fatores internos e externos, tais como o genótipo17, gênero17, acasalou estado17, criação de densidade30, ritmo circadiano31,32e comida de qualidade3 , 8 , 16, ingestão de alimentos de influência. Portanto, a alimentação duração talvez precise ser ajustado de acordo com as condições experimentais específicas. Além de facilitar a quantificação da ingestão de alimentos, cores de alimentos também são usadas para avaliar opções de comida a2,19,27e visualizar o menisco em uma conta no CAFE ensaio12.
Aqui, apresentamos uma protocolo combinado manipulação da atividade neuronal com abordagem de criação de etiquetas de tintura. Esta estratégia tem sido provada útil em nosso estudo neurogenetic alimentando o controle em adultos de moscas de fruta24. O método de Pontuação visual permite uma rápida estimativa do consumo de alimentos; assim, é útil para o rastreio através de um grande número de estirpes em tempo hábil. Os candidatos a partir da tela são então analisados em detalhe, usando um método colorimétrico para fornecer objectivas e quantificação exacta em estudo adicional.
Além de ensaios de alimentação, também descrevemos o thermogenetic27,33,34,35 e optogenetic36 métodos forçosamente ativando neurônios alvo em Drosophila. Para ativar os neurônios por thermogenetic a operação é simples e conveniente com Drosophila transitória do Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que é um canal de cação de temperatura e voltagem-dependente que aumenta a excitabilidade neuronal quando a temperatura ambiente temperatura se eleva acima de 23 ° C33,,37; no entanto, testes com animais em altas temperaturas podem produzir efeitos adversos sobre o comportamento. Outra abordagem eficaz para ativar os neurônios em Drosophila é usando o optogenetics com CsChrimson36, que é uma variante avermelhado do channelrhodopsin que aumenta a excitabilidade dos neurônios quando expostos à luz. Optogenetics oferece a maior resolução temporal e a menor perturbação de comportamentos do que thermogenetics. Combinando a medição quantitativa de ingestão de alimentos com a manipulação da atividade neuronal representa uma abordagem eficaz para estudar os mecanismos neurais de alimentação.
Descrevemos em detalhe a preparação da câmara de alimentação e as moscas a ser testado. Usando moscas Taotie-Gal4 como um modelo24, descrevemos ativando neurônios por thermogenetics e optogenetics. Dois ensaios de quantificação do consumo de alimento com comida tingir-etiquetados são também descritos no protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório concentra-se no processo técnico de ensaios de alimentação corante-rotulagem de consumo de alimentos no contexto de thermogenetic e ativação de optogenetic para manipular os neurônios controlando a alimentação. Este protocolo simples e de confiança vai ajudar a elucidar a função dos neurônios do candidato na alimentação de controle, para medir a preferência alimentar de moscas e para identificar novos jogadores nos circuitos de controle de alimentação através de telas de genética basead…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional pesquisa básica programa da China (2012CB825504), Nacional Natural Science Foundation da China (91232720 e 9163210042), da Academia Chinesa de Ciências (CAS) (GJHZ201302 e SMC015-QYZDY-SSW), Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1119434) e 100-talentos programa de CAS para Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
