Combinar el análisis cuantitativo de la toma de comida y por la fuerza activando las neuronas para estudiar apetito en Drosophila
Summary
Ensayos cuantitativos de consumo de alimentos con alimentos teñido proporcionan un robusto y alto rendimiento significa evaluar motivación alimentación. Combinando el análisis de consumo de alimentos con thermogenetic y optogenetic pantallas es un poderoso enfoque para investigar los circuitos neurales subyacentes apetito en adulto melanogaster del Drosophila.
Abstract
Consumo de alimentos está bajo el estricto control del cerebro, que integra el estado fisiológico, palatabilidad y contenido nutricional de los alimentos y cuestiones comandos para iniciar o detener la alimentación. Descifrar los procesos que subyacen a la toma de decisiones oportuna y moderada alimentación tiene importantes implicaciones en nuestra comprensión de Trastornos fisiológicos y psicológicos relacionados con la alimentación de control. Métodos simples, cuantitativos y robustos se requiere medir la ingestión de alimentos de los animales después de la manipulación experimental, como el aumento por la fuerza de las actividades de ciertas neuronas de destino. Aquí, presentamos tinte etiquetado basado en ensayos de alimentación para facilitar el estudio neurogenetic del control de la alimentación en adultos moscas de la fruta. Revisión de ensayos de alimentación disponibles y luego describir nuestros métodos paso a paso de configuración de análisis, que combinan thermogenetic y manipulación de optogenetic de neuronas control alimentación motivación con ensayo de ingesta de alimentos etiquetados de tinte. También discutimos las ventajas y limitaciones de nuestros métodos, en comparación con otros ensayos de alimentación, para ayudar a los lectores a elegir un ensayo apropiado.
Introduction
Cuantificar la cantidad de alimento ingerido es importante para la evaluación de múltiples aspectos de la alimentación de los controles por el cerebro en respuesta a las necesidades internas (por ejemplo, Estados de hambre) y factores externos (como la palatabilidad y calidad de los alimentos)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. en los últimos años, los esfuerzos de descifrar los sustratos neurales de control de alimentación en Drosophila conducen al desarrollo de múltiples ensayos para cuantificar la cantidad de comida ingerida directamente o servir como un indicador de la motivación de alimentación 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
El capilar alimentador (CAFE) ensayo12,13 fue desarrollado para medir la cantidad de consumo de alimentos líquidos en un microcapillary de vidrio. El ensayo CAFE es muy sensible y reproducible17 y simplifica la medición de consumo de alimentos, especialmente para cuantificar la alimentación a largo plazo18. Sin embargo, este análisis requiere las moscas para subir a la punta de la microcapillary y alimentar al revés, que no es conveniente para todas las cepas. Además, porque las moscas a probar usando el ensayo CAFE tienen que ser criados en alimentos líquidos, el efecto de estas condiciones en estado de metabolismo o malnutrición potencial de cría queda por determinarse.
La respuesta de extensión probóscide (PER) ensayo11,14 cuenta la frecuencia de respuestas de extensión probóscide hacia toques suaves gotas de alimento. POR ensayo probada como una excelente manera de evaluar la alimentación motivación de marcha individual y evaluar la influencia de la palatabilidad y contenido de alimentos18,19. Sin embargo, no es una cuantificación directa de la cantidad de ingesta.
Recientemente, se desarrolló un método semiautomático, el manual de ensayo (MAFE)15, de la alimentación. En MAFE, una sola mosca inmovilizada es alimentada manualmente con un microcapillary que contiene los alimentos. Dado que las respuestas de extensión probóscide y consumo de alimentos se pueden supervisar simultáneamente, MAFE es adecuado para la evaluación de valores nutritivos y los efectos de la manipulación farmacológica. Sin embargo, inmovilizar una mosca podría afectar negativamente su rendimiento conductual, incluyendo la alimentación.
Además, la mosca probóscide y Detector de actividad (FlyPAD)10 fue desarrollado para cuantificar automáticamente el comportamiento de alimentación. Utilizando métodos de visión de máquina, FlyPAD registra interacciones físicas entre una mosca y alimentos para cuantificar la frecuencia y duración de las extensiones de la probóscide como indicador de la motivación de alimentación. FlyPAD proporciona un enfoque de alto rendimiento para supervisar las conductas de alimentación de una mosca de movimiento libre, aunque la sensibilidad y la solidez de este sistema está por ser confirmada más a fondo por más estudios12.
Etiquetado estrategias utilizan con frecuencia para estimar la ingestión de alimentos en moscas. Es común etiquetar alimentos con trazadores químicos y, después de la alimentación, medir la cantidad de marcador ingerido para calcular la cantidad de ingesta de alimentos. Trazadores radiactivos16,17,20,21,22,23,24,25 permite la detección a través de la cutícula sin homogeneización de las moscas. Este método ofrece muy baja variabilidad y alta sensibilidad18y es factible de estudio a largo plazo de la ingestión de alimentos. Sin embargo, la disponibilidad de radioisótopos utilizables y diferentes tasas de absorción y excreción deben tenerse en cuenta cuando se trabaja con este ensayo.
Etiquetado y rastreo de ingesta de alimentos con colores no tóxicos de alimentos es un lugar más seguro y más simple alternativa2,3,26,27,28. Moscas se homogeneizaron después de alimentarse con alimentos que contengan colorantes solubles y no absorbibles, y la cantidad de colorante ingerido posteriormente se cuantifica usando un espectrofotómetro3,24,28,29 . La estrategia de etiquetado es fácil de realizar y proporciona alta eficiencia, pero con una salvedad. El volumen de ingesta de tinte ingerido es menor que el volumen real porque la excreción comienza tan pronto como 15 minutos después vuela17de alimentación. Además, el ensayo evalúa la ingesta de alimentos normalmente dentro de un periodo de 60 min, que sólo es conveniente para la investigación de corto plazo alimentación comportamiento24,28. Por otra parte, múltiples factores internos y externos, como el genotipo17, género17, acoplado estado17, cría de densidad30, ritmo circadiano31,32y de calidad de alimentos3 , 8 , 16, influencia la toma de comida. Por lo tanto, la duración de alimentación deba ser ajustado según condiciones experimentales específicas. Además de facilitar la cuantificación de la ingesta de alimentos, colores de alimento también se utilizan para evaluar alimentos opciones2,19,27y visualizar el menisco en un microcapillary en el CAFE ensayo12.
Aquí, presentamos una protocolo combinado manipulación de la actividad neuronal con enfoque etiquetado tinte. Esta estrategia se ha demostrado útil en nuestro estudio neurogenéticas en el control de la alimentación en adultos moscas de la fruta24. El método de puntuación visual permite una rápida estimación de consumo de alimentos; así, es útil para la investigación a través de un gran número de cepas de manera oportuna. Los candidatos de la pantalla entonces se analizan en detalle utilizando un método colorimétrico que proporcionan objetivos y cuantificación precisa de estudios adicionales.
Además de los ensayos de alimentación, también Describimos los thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 métodos y de activar a las neuronas de la blanco en Drosophila. Para activar las neuronas de thermogenetic funcionamiento es simple y conveniente con Drosophila transitorio del Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que es un canal de temperatura y voltaje-bloqueado del catión que aumenta la excitabilidad neuronal cuando el ambiente temperatura se eleva por encima de 23 ° C33,37; sin embargo, pruebas animales a altas temperaturas pueden producir efectos adversos en el comportamiento. Otro método eficaz para activar las neuronas en Drosophila está utilizando optogenetics con CsChrimson36, que es una variante rojo-cambiado de puesto de channelrhodopsin que aumenta la excitabilidad de las neuronas cuando se expone a la luz. Optogenetics ofrece una resolución temporal más alta y menor disturbio a comportamientos que thermogenetics. Combinando la medición cuantitativa de la ingestión de alimentos con la manipulación de la actividad neuronal representa un enfoque eficaz para el estudio de los mecanismos neurales de la alimentación.
Describimos en detalle la preparación de la cámara de alimentación y las moscas a probarse. Usando Gal4 Taotie moscas como un modelo24, describimos las neuronas activadoras thermogenetics y optogenetics. Dos ensayos de cuantificación de consumo de alimentos con alimentos marcados con tinte también se describen en el protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe se centra en el proceso técnico de ensayos de alimentación tinte etiquetado de consumo de alimentos en el contexto de thermogenetic y activación de optogenetic manipular neuronas control de alimentación. Este Protocolo simple y confiable ayudará a dilucidar la función de las neuronas de candidato en la alimentación de control, para medir la preferencia de alimentos de las moscas y para identificar nuevos actores en los circuitos de control alimentación vía pantallas genéticas basadas en la alimenta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por nacional básico de investigación programa de China (2012CB825504), Fundación de Ciencias naturales Nacional de China (91232720 y 9163210042), Academia China de Ciencias (CAS) (GJHZ201302 y QYZDY-SSW-SMC015), Bill y Melinda Gates Programa de Fundación (OPP1119434) y 100 talentos de CAS a Zhu Y..
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
