الجمع بين تناول الطعام الكمية فحوصات وتنشيط الخلايا العصبية لدراسة الشهية في المورفولوجية قسراً
Summary
توفير فحوصات تناول الطعام الكمية مع الأغذية المصبوغة قوية والفائق يعني تقييم الدافع التغذية. الجمع بين تحليل استهلاك الغذاء مع ثيرموجينيتيك وشاشات أوبتوجينيتيك نهج قوية للتحقيق في الدوائر العصبية الكامنة وراء الشهية في تعليم الكبار melanogaster المورفولوجية.
Abstract
استهلاك المواد الغذائية يتم تحت رقابة صارمة من الدماغ، والذي يدمج في الحالة الفسيولوجية واستساغة والمحتويات الغذائية للأغذية، والمسائل الأوامر لبدء تشغيل أو إيقاف التغذية. فك رموز العمليات الأساسية لصنع القرار في الوقت المناسب والمعتدل التغذية يحمل آثار كبيرة في فهمنا للاضطرابات الفسيولوجية والنفسية ذات الصلة بالتغذية عنصر التحكم. أساليب بسيطة، والكمية والقوية مطلوبة لقياس ابتلاع أغذية الحيوانات بعد التلاعب التجريبية، مثل زيادة أنشطة معينة من الخلايا العصبية المستهدفة قسراً. هنا، قمنا بعرض العلامات صبغي فحوصات التغذية لتسهيل دراسة الجينوم تغذية التحكم في ذبابة الفاكهة الكبار. نستعرض فحوصات التغذية المتاحة، وثم وصف أساليب عملنا خطوة بخطوة من الإعداد للتحليل، التي تجمع بين ثيرموجينيتيك والتلاعب أوبتوجينيتيك للسيطرة على الدافع التغذية مع المقايسة المدخول الغذائي المسمى صبغ الخلايا العصبية. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود لأساليب عملنا، بالمقارنة مع فحوصات التغذية الأخرى، لمساعدة القراء على اختيار فحص مناسبة.
Introduction
تقدير كمية الأغذية التي تناولها مهم لتقييم الجوانب المتعددة لتغذية عناصر التحكم بالدماغ في الاستجابة للاحتياجات الداخلية (مثل حالات الجوع) والعوامل الخارجية (مثل نوعية المواد الغذائية واستساغة)1، 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9-في السنوات الأخيرة الجهود لفك رموز ركائز العصبية لتغذية التحكم في المورفولوجية تؤدي إلى تطوير فحوصات متعددة تقدير كمية الأغذية التي تناولها مباشرة أو بمثابة مؤشر لتغذية الدافع 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
12،المقايسة الشعرية المغذية (مقهى)13 وضعت لقياس كمية استهلاك الغذاء السائل في ميكروكابيلاري زجاج. والرزن مقهى حساسة للغاية واستنساخه17 ويبسط بقياس استهلاك الغذاء، خاصة بالنسبة للتحديد الكمي لتغذية طويلة الأجل18. ومع ذلك، يتطلب هذا الفحص الذباب الصعود إلى غيض ميكروكابيلاري وتغذية رأسا، التي ليست مناسبة لجميع سلالات. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الذباب اختبار باستخدام مقايسة مقهى يجب أن تكون تربيتها على الغذاء السائل، يبقى تأثير هذه تربية الظروف في حالة التمثيل الغذائي أو سوء التغذية المحتملة يجب تحديد.
11،المقايسة استجابة ملحق ململه (في)14 حساب تواتر ململه ملحق الاستجابات تجاه لمسات رقيقة من قطرات الغذاء. كل مقايسة ثبت كوسيلة ممتازة لتقييم تغذية الدافع للطيران الفردي وتقويم تأثير استساغة والمحتوى الغذائي،من18إلى19. بيد أنه ليس إجراء تقييم كمي مباشرة من المبلغ المتحصل.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير أسلوب شبه تلقائي، دليل تغذية المقايسة (ماف)15،. في ̯͡، ويتم تغذية ذبابة المعطل تداولها واحد يدوياً مع ميكروكابيلاري التي تحتوي على الأغذية. نظراً لأن يمكن رصد ردود ملحق ململه والاستهلاك الغذائي في نفس الوقت، ̯͡ مناسبة لتقييم القيم الغذائية والآثار للمعالجة الدوائية. ومع ذلك، أن شل حركة الطيران قد تؤثر سلبا على أدائها السلوكية، بما في ذلك التغذية.
بالإضافة إلى ذلك، تطير ململه و “كشف النشاط” (فليباد)10 وضعت لقياس سلوك التغذية تلقائياً. استخدام أساليب الرؤية آلة، فليباد السجلات التفاعلات الفيزيائية بين الطيران والأغذية لتحديد تواتر ومدة التمديد ململه كمؤشر لتغذية الدافع. فليباد يوفر نهجاً الفائق لرصد سلوكيات التغذية من ذبابة التحرك الحر، على الرغم من حساسية ومتانة هذا النظام ما زال كذلك يؤكده أكثر الدراسات12.
كثيرا ما تستخدم استراتيجيات التوسيم لتقدير ابتلاع الغذاء في الذباب. ومن الشائع تسمية الغذاء مع تتبع المواد الكيميائية، وبعد الرضاعة، قياس مقدار الراسم بلعها لحساب كمية الاستهلاك الغذائي. تتبع المشعة16،17،20،21،،من2223،24،25 تسمح للكشف عن طريق بشرة دون تجانس الذباب. هذا الأسلوب يوفر تقلب منخفضة بشكل ملحوظ وحساسية عالية18، وهو عمليا لدراسة طويلة الأجل لتناول الطعام. ومع ذلك، توفر النظائر المشعة للاستخدام ومعدلات مختلفة لامتصاص وإفراز ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند العمل مع هذا التحليل.
التالي، وتعقب تناول الطعام مع ألوان الطعام غير سامة هي أكثر أماناً وأكثر بساطة بديل2،3،26،،من2728. هي تجانس الذباب بعد الرضاعة مع الأغذية التي تحتوي على الأصباغ القابلة للذوبان وغير الامتصاص، ومقدار الصبغة بلعها هو كمياً في وقت لاحق باستخدام جهاز المطياف الضوئي3،،من2428،29 . من السهل القيام باستراتيجية التوسيم ويوفر كفاءة عالية، ولكن مع تحذير. حجم الحصة الغذائية المقدرة من الصبغة بلعها أصغر من الحجم الفعلي لأن يبدأ إفراز أقرب 15 دقيقة بعد بدء الذباب تغذية17. بالإضافة إلى ذلك، يقيم الإنزيم هضم الغذاء عادة في غضون 60 دقيقة، وفقط مناسبة للتحقيق في المدى القصير تغذية السلوك24،28. وعلاوة على ذلك، عوامل داخلية وخارجية متعددة، مثل النمط الوراثي17،17من الجنسين، تزاوج الدولة17، تربية كثافة30وإيقاع سيركاديان31،32و نوعية الأغذية3 , 8 , 16، تأثير تناول الطعام. ولذلك، قد تحتاج مدة الرضاعة تعديلها وفقا لظروف تجريبية محددة. إلى جانب تسهيل التحديد الكمي لتناول الطعام، كما تستخدم ألوان الطعام لتقييم الأغذية الخيارات2،،من1927، وتصور غضروف في ميكروكابيلاري في مقهى المقايسة12.
وهنا، نقدم تلاعب بروتوكول جنبا إلى جنب لنشاط الخلايا العصبية مع نهج صبغ العلامات. هذه الاستراتيجية قد أثبتت جدواها في دراستنا الجينوم على تغذية التحكم في ذبابة الفاكهة الكبار24. يسمح أسلوب التهديف البصرية لإجراء تقدير سريع لاستهلاك الأغذية؛ وهكذا، أنها مفيدة للفحص من خلال عدد كبير من السلالات في الوقت مناسب. ثم يتم تحليل المرشحين من الشاشة بالتفصيل باستخدام أسلوب قياس ألوان لتقديم الهدف وتحديد كمي دقيق في دراسة إضافية.
وإلى جانب فحوصات التغذية، يصف لنا أيضا أساليب36 ثيرموجينيتيك27،35 وأوبتوجينيتيك34،33،لتنشيط الخلايا العصبية المستهدفة في المورفولوجيةقسراً. لتنشيط الخلايا العصبية التي ثيرموجينيتيك عملية بسيطة ومريحة مع المورفولوجية عابر مستقبلات محتملة أنكيرين 1 (dTRPA1)، وهي قناة الأيونات الموجبة عن طريق بوابة درجة الحرارة والجهد الذي يزيد من استثارة الخلايا العصبية عند المحيطة ترتفع درجة الحرارة 23 درجة مئوية33،37؛ ومع ذلك، اختبار الحيوانات في درجات حرارة عالية قد ينتج آثار سلبية على السلوك. تستخدم نهج فعال آخر لتنشيط الخلايا العصبية في المورفولوجية أوبتوجينيتيكس مع كشريمسون36، هو البديل الأحمر تحول من تشانيلرهودوبسين التي تزيد من استثارة الخلايا العصبية عند التعرض للضوء. ويقدم أوبتوجينيتيكس أعلى الأزمنة واضطرابات أقل للسلوكيات من ثيرموجينيتيكس. الجمع بين قياس كمي لتناول الطعام مع التلاعب بنشاط الخلايا العصبية تمثل نهجاً فعالاً لدراسة الآليات العصبية للتغذية.
يصف لنا بالتفصيل إعداد دائرة التغذية والذباب لفحصها. استخدام الذباب Taotie-Gal4 ك نموذج24، يصف لنا تفعيل الخلايا العصبية التي ثيرموجينيتيكس وأوبتوجينيتيكس. كما يتم وصف فحوصات اثنين للتحديد الكمي للاستهلاك الغذائي مع الغذاء صبغ المسمى في البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويركز هذا التقرير على عملية وسم صبغ فحوصات التغذية لاستهلاك الأغذية في السياق ثيرموجينيتيك التقنية وتفعيل أوبتوجينيتيك للتلاعب بالخلايا العصبية مراقبة التغذية. سيساعد هذا البروتوكول بسيطة ويمكن الاعتماد عليها توضيح وظيفة الخلايا العصبية المرشح في تغذية التحكم، لقياس تفضيل الأغذية من …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا الوطنية الأساسية البحث البرنامج الصيني (2012CB825504)، الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية (91232720 و 9163210042)، والأكاديمية الصينية للعلوم () (GJHZ201302 وقيزدي-شمال-SMC015)، بيل وميليندا غيتس برنامج مؤسسة (OPP1119434)، و 100-مواهب من الأكاديمية الصينية للعلوم أن تشو Y..
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
