Combinant les dosages quantitatifs-la prise alimentaire et activation par la force des neurones pour étudier l’appétit chez la drosophile

Summary

Dosages quantitatifs-la prise alimentaire avec de la nourriture teint fournissent un robuste et haut débit moyens d’évaluer la motivation alimentation. Combinant le dosage de la consommation de nourriture avec thermogenetic et optogenetic écrans est une approche puissante pour enquêter sur les circuits neurones sous-tendant l’appétit chez les adultes Drosophila melanogaster.

Abstract

La consommation d’aliments est sous le contrôle étroit du cerveau, qui intègre l’état physiologique, la saveur et le contenu nutritionnel des aliments et des commandes de questions pour démarrer ou arrêter l’alimentation. Décrypter les mécanismes sous-jacents à la prise de décision en temps opportun et modérée l’alimentation comporte des implications majeures dans notre compréhension des troubles physiologiques et psychologiques liés au contrôle de l’alimentation. Méthodes quantitatives, simples et robustes sont nécessaires pour mesurer l’ingestion d’aliments des animaux après la manipulation expérimentale, tels que force augmentant les activités de certains neurones de la cible. Ici, nous avons introduit des tests alimentaires étiquetage-teintée pour faciliter l’étude neurogénétique de contrôle d’alimentation chez la drosophile adulte. Nous examinons les tests alimentaires et ensuite décrire nos méthodes étape par étape de l’installation d’analyse qui combine thermogenetic et optogenetic manipulation des neurones contrôlant l’alimentation motivation avec test d’admission marqués au colorant alimentaire. Nous discuterons les avantages et les limites de nos méthodes, par rapport aux autres tests alimentaires, pour aider les lecteurs à choisir un test approprié.

Introduction

Quantifier la quantité de nourriture ingérée est importante pour évaluer les aspects multiples de l’alimentation des contrôles par le cerveau pour répondre aux besoins internes (tels que les États de la faim) et facteurs externes (tels que la qualité des aliments et la palatabilité)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. ces dernières années, les efforts de déchiffrage les substrats neurones de contrôle d’alimentation chez la drosophile mener à l’élaboration de multiples essais pour quantifier la quantité de nourriture ingérée directement ou de servir d’indicateur de l’alimentation de motivation ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

Le FEeder capillaire (CAFE) dosage^12,13 a été développé pour mesurer la quantité de consommation d’aliments liquides dans un verre microcapillaire. Le dosage du café est très sensible et reproductible¹⁷ et simplifie la mesure de la consommation alimentaire, notamment pour quantifier l’ alimentation à long terme¹⁸. Toutefois, ce test nécessite les mouches de grimper jusqu’à l’extrémité de la microcapillaire et nourrir la tête en bas, qui n’est pas approprié pour toutes les souches. En outre, parce que les mouches à tester à l’aide du test CAFE doivent être élevés sur la nourriture liquide, l’effet de ces conditions sur l’état du métabolisme ou la malnutrition potentielle d’élevage reste encore à déterminer.

Le Proboscis Extension réponse (PER) dosage^11,14 compte la fréquence des réponses extension trompe vers douce touche de gouttes de nourriture. PAR test s’est révélé comme un excellent moyen d’évaluer l’alimentation motivation des mouche individuelle et des ânes l’influence de la palatabilité et le contenu des aliments^18,19. Cependant, il n’est pas une quantification directe du montant de l’apport.

Récemment, une méthode semi-automatique, le manuel d’alimentation¹⁵de dosage (maltais), a été mis au point. En maltais, une seule mouche immobilisée est alimentée manuellement avec un microcapillaire contenant de la nourriture. Étant donné que les réponses d’extension de trompe et la consommation d’aliments peuvent être surveillés en même temps, MAFE est pertinente pour évaluer les valeurs nutritives et les effets des manipulations pharmacologiques. Cependant, immobiliser une mouche aurait un impact négatif sur sa performance comportementale, y compris l’alimentation.

En outre, fly Proboscis et détecteur d’activité (FlyPAD)¹⁰ a été développé pour mesurer automatiquement le comportement alimentaire. En utilisant les méthodes de machine vision, FlyPAD enregistre des interactions physiques entre une mouche et les aliments à quantifier la fréquence et la durée des extensions trompe comme un indicateur de l’alimentation de motivation. FlyPAD fournit une approche de haut-débit pour surveiller les comportements alimentaires d’une mouche de mouvement libre, même si la sensibilité et la robustesse de ce système reste à être confirmée par plusieurs études¹².

Stratégies de marquage sont fréquemment utilisés pour estimer l’ingestion alimentaire chez les mouches. Il est fréquent d’étiqueter les aliments avec des traceurs chimiques et, après s’être nourries, mesurer la quantité de traceur ingéré pour calculer la quantité de nourriture absorbée. Permettre à traceurs radioactifs^{16,17,20,21,22,23,24,25} pour la détection à travers la cuticule sans homogénéisation des mouches. Cette méthode fournit remarquablement faible variabilité et une sensibilité élevée¹⁸et il serait possible d’étude à long terme de la prise alimentaire. Cependant, la disponibilité des radio-isotopes utilisables et différents taux d’absorption et d’excrétion devraient prendre en considération lorsque vous travaillez avec ce test.

Étiquetage et le traçage de la prise alimentaire avec les colorants alimentaires non toxiques est un plus sûr et plus simple variante^2,3,26,27,28. Les mouches sont homogénéisés après s’être nourries avec des aliments contenant des colorants solubles et non résorbables, et le colorant ingéré plus tard doser à l’aide d’un spectrophotomètre^3,24,28,29 . La stratégie d’étiquetage est facile à exécuter et fournit le rendement élevé, mais avec une mise en garde. Le volume de l’apport alimentaire estimé à partir de la teinture ingérée est plus petit que le volume réel parce que l’excrétion commence dès 15 min après le démarrage de mouches alimentation¹⁷. En outre, le test évalue ingestion alimentaire généralement dans un délai de 60 minutes, qui est conçu uniquement pour l’enquête de court terme alimentation comportement^24,28. En outre, plusieurs facteurs internes et externes, tels que le génotype¹⁷, genre¹⁷, accouplés état¹⁷, élevage de densité³⁰, rythme circadien^31,32et nourriture de qualité^{3 , 8 , 16}, influence la prise alimentaire. Par conséquent, la durée d’alimentation devrez peut-être être ajustée en fonction des conditions expérimentales spécifiques. En plus de faciliter la quantification de l’apport alimentaire, colorants alimentaires sont également utilisés pour évaluer la nourriture choix^2,19,27et de visualiser le ménisque dans un microcapillaire CAFE test¹².

Ici, nous introduisons une manipulation protocole combiné de l’activité neuronale avec colorant-étiquetage approche. Cette stratégie a été prouvée utile dans notre étude neurogénétique sur l’alimentation de contrôle dans la drosophile adulte²⁴. La méthode de notation visuelle permet une estimation rapide de la consommation d’aliments ; ainsi, il est utile pour le dépistage par un grand nombre de souches en temps opportun. Les candidats de l’écran sont ensuite analysées en détail à l’aide d’une méthode colorimétrique pour fournir des objectifs et une quantification précise dans une autre étude.

Outre les tests alimentaires, nous décrivons également les thermogenetic^27,33,34,35 optogenetic³⁶ méthodes et d’activation par la force des neurones cibles chez la drosophile. Pour activer les neurones par thermogenetic opération est simple et pratique avec Drosophila Transient Receptor potentiels Ankyrin 1 (dTRPA1), qui est un canal cationique température – et voltage-dépendants qui augmente l’excitabilité neuronale lorsque la température ambiante la température s’élève au-dessus de 23 ° C^33,37; Cependant, animaux à des températures élevées peut produire des effets indésirables sur le comportement. Une autre approche efficace pour activer les neurones chez la drosophile utilise optogenetics avec CsChrimson³⁶, qui est une variante décalée vers le rouge de channelrhodopsin qui augmente l’excitabilité des neurones lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Optogenetics offre la meilleure résolution temporelle et la moindre perturbation des comportements que thermogenetics. Combinant des mesures quantitatives de la prise alimentaire avec la manipulation de l’activité neuronale représente une approche efficace pour étudier les mécanismes neurones de l’alimentation.

Nous décrivons en détail la préparation de la chambre d’alimentation et les mouches à tester. À l’aide de mouches Taotie-Gal4 comme un modèle²⁴, nous décrivons activation des neurones par thermogenetics et optogenetics. Deux essais de quantification de la consommation d’aliments avec marqués au colorant alimentaire sont également décrites dans le protocole.

Protocol

1. préparation de la chambre d’alimentation Remarque : La chambre d’alimentation pour marquage colorant alimentaire test se compose de deux parties : le conteneur extérieur (comme un couvercle) et l’intérieur conteneur (comme source de nourriture). Modifier le conteneur à l’extérieur d’un flacon de verre pour la culture des Drosophila (d’un diamètre intérieur de 31,8 mm) et une hauteur de 80 mm (Figure 1 a, …

Representative Results

Écran thermogenetic. Appétit anormalement élevé provoque la prise alimentaire élevée, indépendamment des besoins physiologiques. Nous avons utilisé ce régime à un haut débit de conception comportementale écran pour obtenir des handles génétiques des neurones liés à la faim et rassasiés des États (Figure 1). L’écran a donné Taotie-Gal424. Lorsque…

Discussion

Ce rapport met l’accent sur le processus technique de tests alimentation colorant-étiquetage de la consommation alimentaire dans le contexte de thermogenetic et optogenetic activation pour manipuler des neurones contrôlant l’alimentation. Ce protocole simple et fiable vous aidera à élucider la fonction des neurones de candidat dans l’alimentation de contrôle, pour mesurer les préférences alimentaires des mouches et d’identifier de nouveaux joueurs dans l’alimentation des circuits de contrôle via écrans…

Materials

UAS-CsChrimson	Bloomintoon	55135
UAS-dTrpA1	Bloomintoon	26263
TDC1-GAL4	Bloomintoon	9312
TDC2-GAL4	Bloomintoon	9313
sNPF-GAL4			Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4			Provided by Y. Rao
TH-GAL4			Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4			Provided by Y. Rao
AKH-GAL4			Provided by Y. Rao
dip2-GAL4			Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4			Provided by J. Carlson
Agarose	Biowest	G-10
Sucrose	Sigma	S7903
Erioglaucine disodium salt	Sigma	861146
all-trans-retinal	Sigma	R2500	stored in darkness
Triton X-100	Amresco	9002-93-01
Fly food		1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH
1x PBS buffer		1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer		1X PBS with 1% Triton X-100
Grinding mill	Shang Hai Jing Xin	Tissuelyser-24
Incubator	Ning Bo Jiang Nan	HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate	Chang Zhou Bo Yuan	CJJ 78-1
Spectrometer	Thorlabs	CCS200/M
Microplate Spectrophotometer	Thermo Scientific	Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope	Leica	M205FA
Stereo microscope	Leica	S6E
Outside container	Jiang Su Hai Men	glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container	Beijing Yi Ran machinery factory	plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes	Hai Men Ning Mong
96 well plate	Corning Incorporated	Costar 3599
LEDs	Xin Xing Yuan Guangdian	607 nm, 3W	https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058