Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren
Summary
Quantitative Nahrungsaufnahme Assays mit gefärbten Lebensmittel bieten eine robuste und Hochdurchsatz-Mittel zur Fütterung Motivation zu bewerten. Kombination des Lebensmittel Verbrauch Tests mit thermogenetischen und optogenetische Bildschirme ist ein leistungsfähiger Ansatz zu untersuchen, die neuronale Schaltkreise, die zugrunde liegenden Appetit bei Erwachsenen Drosophila Melanogaster.
Abstract
Verzehr von Lebensmitteln ist unter strenge Kontrolle des Gehirns, die die physiologischen Zustand, Schmackhaftigkeit und Ernährung Inhalt der Ernährungs- und Themen-Befehle zum Starten und stoppen Fütterung integriert. Entschlüsseln die Verfahren für die Beschlussfassung rechtzeitig und moderate Hauptimplikationen trägt in unserem Verständnis der physiologischen und psychologischen Erkrankungen im Zusammenhang mit der Kontrolle Fütterung Fütterung. Robustere, einfach und quantitative Methoden sind erforderlich, um die Nahrungsaufnahme der Tiere nach experimentelle Manipulation, wie die zwangsweise Erhöhung der Aktivitäten von bestimmten Ziel-Neuronen zu messen. Hier führten wir ein Farbstoff-Kennzeichnung-basierte Fütterung Assays zur Erleichterung die neurogenetic Studie der Fütterung Kontrolle bei Erwachsenen Fruchtfliegen. Wir überprüfen zur Verfügung Fütterung Assays, und dann beschreiben unsere Methoden Schritt für Schritt von Setup zur Analyse, die thermogenetischen kombinieren und optogenetische Manipulation von Neuronen Steuern Fütterung Motivation mit Farbstoff-markierten Lebensmittel Aufnahme Assay. Wir diskutieren auch die Vorzüge und Grenzen unserer Methoden, im Vergleich zu anderen Fütterung Assays, wählen Sie einen entsprechenden Assay Lesern helfen.
Introduction
Die Menge der aufgenommenen Nahrung die Quantifizierung ist wichtig für die Bewertung mehrere Aspekte der Steuerung durch das Gehirn reagiert auf die internen Bedürfnisse (z. B. Hunger Staaten) und externe Faktoren (z. B. Lebensmittelqualität und Schmackhaftigkeit)1, Fütterung 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in den letzten Jahren die Bemühungen der Entzifferung der neurale Substrate der Fütterung Kontrolle in Drosophila führen zu die Entwicklung von mehreren Assays direkt die Menge der aufgenommenen Nahrung zu quantifizieren oder dienen als Indikator für die Fütterung von Motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Die Kapillare Einzug (CAFE) Assay12,13 wurde entwickelt, um die Menge des Konsums von flüssigen Lebensmitteln in ein Glas Microcapillary zu messen. Die CAFE-Assay ist sehr empfindlich und reproduzierbare17 und vereinfacht die Messung der Verzehr von Lebensmitteln, vor allem zur Quantifizierung der langfristige Fütterung18. Dieser Test erfordert jedoch die fliegen an der Spitze der Microcapillary Klettern und füttern verkehrt, die eignet sich nicht für alle Stämme. Zusätzlich, da die fliegen, mit CAFE-Assay getestet werden auf flüssige Nahrung aufgezogen werden müssen, bleibt die Wirkung dieser Aufzuchtsbedingungen auf Stoffwechsel-Status oder die möglichen Unterernährung ermittelt werden.
Der Rüssel Erweiterung Antwort (PER) Assay11,14 zählt die Häufigkeit der Rüssel Erweiterung Antworten auf sanfte Berührungen von Lebensmittel Tropfen. PRO Test erwies sich als eine hervorragende Möglichkeit, bewerten Fütterung Motivation der einzelnen Fliege und Esel den Einfluss der Schmackhaftigkeit und Inhalt der Nahrung18,19. Es ist jedoch keine direkte Quantifizierung der Einnahme-Menge.
Vor kurzem wurde ein halbautomatisches Verfahren, die manuelle Zuführung Assay (MAFE)15, entwickelt. In MAFE wird eine Fliege immobilisierte manuell mit einem Microcapillary mit Essen zugeführt. Angesichts der Tatsache, dass Rüssel Erweiterung Antworten und Verzehr von Lebensmitteln gleichzeitig überwacht werden können, eignet sich MAFE für die Beurteilung der Nährwerte und die Auswirkungen der pharmakologischen Manipulation. Jedoch könnte eine Fliege Immobilisierung seine Verhaltensstörungen Leistung, einschließlich Fütterung beeinträchtigen.
Darüber hinaus fliegen Rüssel und Aktivität-Detektor (FlyPAD)10 wurde entwickelt, um automatisch Fressverhalten zu quantifizieren. Mit Machine Vision Methoden zeichnet FlyPAD physikalische Wechselwirkungen zwischen einer Fliege und Lebensmittel, die Häufigkeit und Dauer der Rüssel Erweiterungen als Indikator der Fütterung Motivation zu quantifizieren. FlyPAD bietet ein Hochdurchsatz-Ansatz für die Fütterungen Verhalten einer frei beweglichen Fliege zu überwachen, wenn auch die Empfindlichkeit und die Robustheit dieses Systems noch mehr weiter bestätigt werden12Studien.
Kennzeichnung Strategien werden häufig verwendet, um Nahrungsaufnahme fliegen zu schätzen. Es ist üblich, beschriften Sie Lebensmittel mit chemischen Tracer und nach der Fütterung, Messen Sie die Menge des aufgenommenen Tracer, die Menge der Nahrungsaufnahme zu berechnen. Radioaktiver Tracer16,17,20,21,22,23,24,25 ermöglichen die Erkennung durch die Kutikula ohne Homogenisierung der fliegen. Diese Methode bietet bemerkenswert geringe Variabilität und hohe Empfindlichkeit18und ist für Langzeit-Studie der Nahrungsaufnahme möglich. Allerdings sollte die Verfügbarkeit von nutzbaren Radioisotopen und verschiedene Sätze von Absorption und Ausscheidung berücksichtigt werden bei der Arbeit mit dieser Assay.
Kennzeichnung und Rückverfolgung Nahrungsaufnahme mit ungiftige Lebensmittelfarben ist eine sicherere und einfachere alternative2,3,26,27,28. Fliegen werden nach der Fütterung mit Lebensmitteln, die nicht resorbierbaren und lösliche Farbstoffe homogenisiert und die Menge des aufgenommenen Farbstoffs ist später quantifiziert mit einem Spektrophotometer3,24,28,29 . Die Kennzeichnung Strategie ist einfach durchzuführen und bietet eine hohe Effizienz, aber mit einer Einschränkung. Das Volumen der Nahrungsaufnahme geschätzt aus den aufgenommenen Farbstoff ist kleiner als das tatsächliche Volumen weil Ausscheidung bereits 15 Minuten beginnt nach dem Fliegen fressen17. Darüber hinaus bewertet der Assay Nahrungsaufnahme in der Regel binnen 60 Minuten, die nur geeignet für die Untersuchung von kurzfristigen Fütterung Verhalten24,28. Darüber hinaus mehrere interne und externe Faktoren, wie z. B. Genotyp17, Geschlecht17, Stand17, Aufzucht, Dichte30, zirkadianen Rhythmus31,32und Lebensmittel Qualität3 gedeckt , 8 , 16, Einfluss Nahrungsaufnahme. Daher müssen die Fütterung Dauer nach bestimmten experimentellen Bedingungen angepasst werden. Neben die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme zu erleichtern, dienen Lebensmittelfarben, Essen Auswahl2,19,27zu bewerten und den Meniskus in einer Microcapillary im CAFE Assay12zu visualisieren.
Hier stellen wir eine Protokoll kombiniert Manipulation von neuronaler Aktivität mit Farbstoff-labeling-Ansatz. Diese Strategie ist in unserer neurogenetic Studie zur Fütterung Kontrolle in Erwachsenen Fruchtfliegen24nützlich erwiesen. Die visuelle scoring-Methode ermöglicht eine schnelle Einschätzung der Verzehr von Lebensmitteln; Daher ist es sinnvoll für das Screening durch eine große Anzahl von Stämmen in einer zeitgemäßen Weise. Die Kandidaten vom Bildschirm werden dann im Detail mit einer kolorimetrischen Verfahren bieten Objektive und präzise Quantifizierung in zusätzliche Studie analysiert.
Neben der Fütterung Assays erläutern wir im folgenden die thermogenetischen27,33,34,35 optogenetische36 Methoden und Ziel Neuronen in Drosophilagewaltsam zu aktivieren. Neuronen von thermogenetischen aktivieren Bedienung ist einfach und bequem mit Drosophila Transienten Rezeptor potenzielle Ankyrin-Repeat-(AR)-1 (dTRPA1), die eine Temperatur und Spannung-gated kation Kanal, die neuronale Erregbarkeit erhöht wenn die Umgebungstemperatur Temperatur steigt über 23 ° C33,37; jedoch könnte die Tiere bei hohen Temperaturen beim Testen nachteilige Auswirkungen auf Verhalten erstellt. Ein weiteres effektiver Ansatz zur Aktivierung von Neuronen in Drosophila nutzt optogenetik mit CsChrimson36, das ist eine rot-verschoben Variante des Channelrhodopsin, das erhöht die Erregbarkeit der Neuronen bei Lichteinfall. Optogenetik bietet höhere zeitliche Auflösung und weniger Störungen für Verhaltensweisen als Thermogenetics. Die quantitative Messung der Nahrungsaufnahme mit der Manipulation von neuronaler Aktivität zu verbinden, stellt einen effektiven Ansatz zur Erforschung der neuronalen Mechanismen der Fütterung.
Wir beschreiben ausführlich die Vorbereitung der Füllraum und die fliegen getestet werden. Mit Taotie-Gal4 fliegen als ein Modell24, beschreiben wir aktivierende Neuronen durch Thermogenetics und optogenetik. Zwei Tests der Quantifizierung der Verzehr von Lebensmitteln mit Farbstoff-markierten Lebensmittel werden ebenfalls im Protokoll beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht konzentriert sich auf den technischen Prozess der Farbstoff-Kennzeichnung Fütterung Assays der Verzehr von Lebensmitteln im Rahmen von thermogenetischen und optogenetische Aktivierung von Neuronen zu manipulieren controlling Fütterung. Dieses einfache und zuverlässige Protokoll wird dazu beitragen, die Funktion der Kandidat Neuronen in der Fütterung kontrollieren, Essen bevorzugt fliegen zu messen und zu identifizieren, neue Spieler in der Fütterung Steuerstromkreisen über Fütterung-basierten geneti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch National Basic Research Program of China (2012CB825504), der National Natural Science Foundation of China (91232720 und 9163210042), chinesische Akademie der Wissenschaften (CAS) (GJHZ201302 und QYZDY-SSW-SMC015), Bill und Melinda Gates Stiftung (OPP1119434) und 100-Talente-Programm von CAS, Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
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