Kombinere kvantitative matinntaket analyser og makt aktivere Neurons å studere appetitt i Drosophila

Summary

Kvantitativ matinntaket analyser med farget mat gir robust og høy gjennomstrømming betyr å evaluere fôring motivasjon. Kombinere mat forbruk analysen med thermogenetic og optogenetic skjermer er en effektiv tilnærming til å undersøke nevrale kretser underliggende appetitt i voksen Drosophila melanogaster.

Abstract

Matforbruk er under stram kontroll av hjernen, som integrerer den fysiologiske status, palatability og ernæringsmessige innholdet av mat og problemer-kommandoer for å starte eller stoppe fôring. Tyde prosessene underliggende beslutningsprosessen betimelig og moderat fôring bærer store konsekvenser i vår forståelse av fysiologiske og psykologiske sykdommer relatert til fôring kontroll. Enkel, kvantitative og robust metoder er pålagt å måle mat inntak av dyr etter eksperimentelle manipulasjon, for eksempel øke makt aktivitetene til visse mål neurons. Her introdusert vi fargestoff-merking-baserte fôring analyser for å lette neurogenetic studiet av fôring kontroll i voksen frukt fluer. Vi se tilgjengelige fôring analyser og deretter beskriver vår metoder trinnvise fra oppsettet for analyse, som kombinerer thermogenetic og optogenetic manipulering av neurons kontrollere fôring motivasjon med fargestoff-merket mat inntak analysen. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger av våre metoder, sammenlignet med andre fôring analyser, å hjelpe leserne velge en passende analysen.

Introduction

Kvantifisere mengden mat inntak er viktig for å vurdere flere aspekter av fôring kontroller av hjernen i å svare på de interne behov (for eksempel sult stater) og eksterne faktorer (som mat og palatability)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. i de siste årene, innsatsen til tyde nevrale substrater av fôring kontroll i Drosophila føre til utviklingen av flere analyser direkte kvantifisere mengden mat inntatt eller tjene som en indikator på fôring motivasjon ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

Kapillær mater (CAFE) analysen^12,13 ble utviklet for å måle mengden av forbruk av væsken mat i et glass microcapillary. CAFE analysen er svært sensitive og reproduserbar¹⁷ og forenkler måling av matforbruk, spesielt for kvantifisere langsiktige fôring¹⁸. Denne analysen krever imidlertid fluene å klatre til spissen av microcapillary og fôr opp-ned, som passer ikke for alle stammer. I tillegg fordi fluene skal testes med CAFE analysen har ekteskapsløftene på flytende mat, gjenstår effekten av disse oppdrett forholdene på metabolisme status eller potensielle underernæring for å bli bestemt.

Snabel forlengelsen svar (PER) analysen^11,14 teller svarfrekvensen snabel forlengelsen mot mild innslag mat dråper. PER analysen viste seg som en utmerket måte å evaluere fôring personlige fly og esler påvirkning av palatability og innhold mat^18,19. Men er det ikke en direkte kvantifisering av inntak beløp.

Nylig ble en halvautomatisk metode, manuell mating analysen (MAFE)¹⁵, utviklet. I MAFE mates en enkelt immobilisert fly manuelt med et microcapillary som inneholder mat. Gitt at snabel forlengelsen svar og matforbruk kan overvåkes samtidig, er MAFE egnet for å vurdere næringsstoffer verdier og effekten av farmakologiske manipulasjon. Imidlertid kan immobilizing et fly negativt påvirke sin opptreden ytelse, inkludert fôring.

I tillegg fly snabel og aktivitet detektor (FlyPAD)¹⁰ ble utviklet for å automatisk kvantifisere fôring atferd. Bruker maskinen visjon metoder, poster FlyPAD fysisk interaksjon mellom fly og mat å kvantifisere hyppighet og varighet av snabel utvidelser som indikator for fôring motivasjon. FlyPAD gir en høy gjennomstrømming tilnærming til å overvåke fôring atferd av et fritt bevegelige fly, selv om den sensitivitet og robusthet av dette systemet gjenstår for å bekreftes av flere studier¹².

Merking strategier brukes ofte til å estimere mat inntak i fluer. Det er vanlig å merke mat med kjemiske tracers og, etter mating, måle mengden av inntatt tracer til å beregne mengden av matinntaket. Radioaktivt tracers^{16,17,20,21,22,23,24,25} tillater påvisning gjennom cuticle uten homogenisering fluene. Denne metoden gir usedvanlig lave variasjon og høy følsomhet¹⁸, og mulig for langsiktige studier av matinntaket. Men bør tilgjengeligheten av brukbare radioisotopes og ulike priser absorbansen og ekskresjon tas i betraktning når du arbeider med denne analysen.

Merking og spore matinntaket med giftig mat farger er en tryggere og enklere alternativ^2,3,26,27,28. Fluene er homogenisert etter fôring med mat som inneholder løselig og ikke-absorberbare fargestoffer, og mengden av inntatt fargestoff er senere kvantifisert bruker et spektrofotometer^3,24,28,29 . Merking strategien er enkel å utføre og gir høy effektivitet, men med en påminnelse. Volumet av matinntaket beregnet fra inntatt fargestoff er mindre enn det faktiske volumet fordi utskillelse begynner så tidlig som 15 min etter fluer startfôring¹⁷. I tillegg vurderer analysen mat inntak vanligvis innen en 60 minutters periode, som er kun egnet for undersøkelse av kortsiktige fôring atferd^24,28. Dessuten parret flere interne og eksterne faktorer, for eksempel genotype¹⁷, kjønn¹⁷, staten¹⁷, oppdrett tetthet³⁰, døgnrytmen^31,32og mat kvalitet^{3 , 8 , 16}, innflytelse matinntaket. Fôring varigheten må derfor kan justeres i henhold til bestemte eksperimentelle forhold. I tillegg til å tilrettelegge kvantifisering av matinntak, brukes også mat farger å vurdere mat valg^2,19,27, og visualisere meniscus i en microcapillary i CAFE analysen¹².

Her introduserer vi en protokoll kombinert manipulering av neuronal aktivitet med fargestoff-merking tilnærming. Denne strategien har vist seg nyttig i vår neurogenetic studie om fôring kontroll i voksen frukt fluer²⁴. Den visuelle scoring metoden tillater en rask estimering av matforbruk; Dermed er det nyttig for screening gjennom et stort antall stammer i tide. Kandidater fra skjermen analyseres deretter i detalj ved hjelp av en kolorimetrisk metode mål og presis kvantifisering i flere studier.

Foruten de fôring analyser beskriver vi også thermogenetic^27,33,34,35 og optogenetic³⁶ metodene for aktivering makt mål nerveceller i Drosophila. Aktiverer nerveceller ved thermogenetic drift er enkelt og bekvemt med Drosophila forbigående reseptor potensielle Ankyrin 1 (dTRPA1), som er en temperatur – og spenning-gated kasjon kanal som øker neuronal excitability når omgivende temperaturen stiger over 23 ° C^33,37; men kan tester dyr ved høye temperaturer produsere bivirkninger på atferd. En annen effektive tilnærmingen å aktivere nerveceller i Drosophila bruker optogenetics med CsChrimson³⁶, som er en rød-skiftet variant av channelrhodopsin som øker excitability av neurons når de utsettes for lys. Optogenetics tilbyr høyere midlertidig løsning og mindre forstyrrelser til atferd enn thermogenetics. Kombinere kvantitativ måling av matinntaket med manipulering av neuronal aktivitet representerer en effektiv tilnærming for å studere nevrale mekanismer av fôring.

Vi beskriver i detalj utarbeidelse av fôring kammeret og fluene skal testes. Bruker Taotie-Gal4 flyr som en modell²⁴, beskriver vi aktivere neurons av thermogenetics og optogenetics. To analyser for kvantifisering av matforbruk med fargestoff-merket mat er også beskrevet i protokollen.

Protocol

1. klargjør fôring kammeret Merk: Fôring kammeret for fargestoff-merking fôring analysen består av to deler: utenfor beholderen (som et lokk) og innsiden beholder (som matkilde). Endre beholderen utenfor fra et hetteglass for dyrking Drosophila (en indre diameter 31,8 mm) og en høyde på 80 mm (figur 1A, 1 C). Dekke bunnen av beholderen med et lag av 1% agarose (5 mL) å holde fôring oppsettet riktig fukt…

Representative Results

Thermogenetic skjermen. Unormalt økt appetitt forårsaker opphøyet matinntak, uavhengig av fysiologiske behov. Vi utnyttet denne ordningen til å utforme en høy gjennomstrømming atferdsmessige skjermen å få genetisk håndtak av neurons knyttet til å sult og mett stater (figur 1). Skjermen ga Taotie-Gal424. Når Taotie-Gal4 neurons ble tvangsflyttet ak…

Discussion

Denne rapporten fokuserer på teknisk prosessen med fargestoff-merking fôring analyser mat forbruk i konteksten av thermogenetic og optogenetic aktivisering å manipulere neurons fôring. Denne enkel og pålitelig protokollen vil bidra til å belyse funksjonen kandidat neurons fôring måle mat preferanse av fluer, og å identifisere romanen spillere i fôring kontroll kretser via fôring-baserte genetisk skjermer²⁴.

Fargestoff merking strategi er mulig i gransker kort…

Materials

UAS-CsChrimson	Bloomintoon	55135
UAS-dTrpA1	Bloomintoon	26263
TDC1-GAL4	Bloomintoon	9312
TDC2-GAL4	Bloomintoon	9313
sNPF-GAL4			Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4			Provided by Y. Rao
TH-GAL4			Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4			Provided by Y. Rao
AKH-GAL4			Provided by Y. Rao
dip2-GAL4			Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4			Provided by J. Carlson
Agarose	Biowest	G-10
Sucrose	Sigma	S7903
Erioglaucine disodium salt	Sigma	861146
all-trans-retinal	Sigma	R2500	stored in darkness
Triton X-100	Amresco	9002-93-01
Fly food		1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH
1x PBS buffer		1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer		1X PBS with 1% Triton X-100
Grinding mill	Shang Hai Jing Xin	Tissuelyser-24
Incubator	Ning Bo Jiang Nan	HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate	Chang Zhou Bo Yuan	CJJ 78-1
Spectrometer	Thorlabs	CCS200/M
Microplate Spectrophotometer	Thermo Scientific	Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope	Leica	M205FA
Stereo microscope	Leica	S6E
Outside container	Jiang Su Hai Men	glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container	Beijing Yi Ran machinery factory	plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes	Hai Men Ning Mong
96 well plate	Corning Incorporated	Costar 3599
LEDs	Xin Xing Yuan Guangdian	607 nm, 3W	https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058