Analyse de Microfluidic unicellulaire de Bacillus subtilis
Summary
Nous présentons une méthode pour l’analyse de la microfluidique de lignées de cellules bactériennes individuelles à l’aide de Bacillus subtilis à titre d’exemple. La méthode surmonte les lacunes des méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie en permettant l’observation de centaines de générations de cellules dans des conditions de croissance étroitement contrôlable et uniforme.
Abstract
La technologie Microfluidic surmonte beaucoup des restrictions aux méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie. Contrairement aux méthodes de culture en vrac, il offre une résolution de cellule unique et longue observation times s’étendant sur des centaines de générations ; à la différence d’agarose microscopie axée sur le pavé, il a des conditions de croissance uniforme qui peuvent être contrôlées. Parce que le flux continu de milieu de croissance isole les cellules dans un dispositif microfluidique de variations imprévisibles dans l’environnement chimique local causée par la croissance des cellules et du métabolisme, authentiques changements dans l’expression des gènes et la croissance des cellules en réponse à des stimuli spécifiques peuvent être observés avec plus de confiance. Bacillus subtilis est utilisé ici comme une espèce de bactérie modèle afin de démontrer une « machine de la mère »-méthode d’analyse cellulaire de type. Nous montrons comment construire et sonder un dispositif microfluidique, chargez-le avec cellules, initier l’imagerie microscopique et exposer des cellules à un stimulus en passant d’un milieu à l’autre. Un journaliste sensibles aux stress est utilisé comme un exemple de révéler le type de données qui pourraient être obtenus par cette méthode. Nous discutons également brièvement plus loin les applications de cette méthode pour d’autres types d’expériences, telles que l’analyse de la sporulation bactérienne.
Introduction
Une des caractéristiques plus frappantes de la vie sur terre est sa grande résistance et sa variété. Un objectif central de la biologie moléculaire est de comprendre la logique par lequel les cellules utilisent gènes et protéines pour maximiser leur croissance et leur condition physique sous une grande variété de conditions environnementales. Pour atteindre cet objectif, les scientifiques doivent pouvoir observer en toute confiance comment les cellules individuelles se développent, divisent et expriment leurs gènes sous un ensemble donné de conditions, notant comment les cellules réagissent aux changements ultérieurs dans leur environnement. Toutefois, des méthodes analytiques traditionnelles en microbiologie ont des limitations techniques qui affectent les types de questions qui peuvent être abordées. Par exemple, les analyses axées sur la culture en vrac ont été très utiles au cours des années, mais ils offrent uniquement des données au niveau des populations qui peuvent masquer des variations significatives de cellule-cellule ou le comportement des petites sous-populations de cellules dans la population totale. Analyses de cellule unique de bactéries vivantes, basés sur la microscopie photonique révèlent unicellulaires comportement mais sont également limités techniquement. Bactéries sont généralement immobilisées sur agarose tampons contenant le milieu de croissance, mais la vue au microscope de cellules croissance et division des foules et épuise les nutriments disponibles après quelques cycles cellulaires, limitant considérablement l’observation heure1, 2. En outre, l’appauvrissement local de nutriments et de l’accumulation concomitante de sous-produits métaboliques en raison de la croissance des cellules changent constamment le milieu de croissance des cellules locales de manières qui sont difficiles à mesurer ou à prévoir. Ces changements environnementaux à l’aide de tampons d’agarose posent un défi aux études de comportements stationnaire ou des réponses cellulaires aux changements spécifiques dans des conditions de croissance3.
Technologie de microfluidique, dans lequel un milieu liquide est a coulé en continu au moyen de dispositifs microfabriques offre une solution aux limitations expérimentales classiques. Un dispositif microfluidique peut garder les cellules individuelles en position pour la microscopie des cellules vivantes tandis que la circulation de milieu de croissance constamment fournit des cellules avec des aliments frais et lave les sous-produits métaboliques et les cellules excédentaires, créant ainsi une croissance très homogène environnement. Dans des conditions de croissance constant, comportements cellulaires peuvent être observés dans l’isolement de l’influence des facteurs environnementaux, permettant une vue dégagée de la logique interne des cellules. Car l’écoulement du fluide empêche le dispositif microfluidique de devenir bondé de cellules, observation des lignées de cellules du même pour des dizaines ou des centaines de générations devient possible4,5. Ces périodes d’observation longue de permettre la détection des comportements autrement indécelables cellules rares ou à long terme. Enfin, la composition du milieu qui traverse l’appareil peut être modifié à volonté, permettant aux cellules à observer car ils réagissent à l’apparition d’un stress ou à l’introduction ou la suppression d’un composé particulier.
Microfluidique jouit déjà d’un certain nombre d’applications importantes. Par exemple, il a été utilisé dans les tissus, orgue ou dispositifs de corps-on-a-chip, dans laquelle plusieurs types de cellules humaines sont conjointement cultivés pour simuler un en vivo condition6; pour l’étude du mouvement de nématodes dans les environnements microstructurées7; pour examiner les interactions entre les biofilms bactériens (par exemple, 8) ; et pour l’encapsulation et la manipulation de petits volumes de cellules ou de produits chimiques (p. ex., 9). Dispositifs microfluidiques sont également devenus plus en plus populaires dans le domaine de la microbiologie (pour les excellentes critiques, voir 10 et 11), surtout que leur physique et les propriétés d’écoulement sont bien assorties aux niches microbiennes naturelles12. Par exemple, microfluidique a été récemment employée par microbiologistes à de telles fins comme mesure précisément cellule croissance et division13,14,15, analyse de mouvement pathogène16, suivi quorum télédétection17 et physiologiques transitions18et pour la protéine comptant19, parmi beaucoup d’autres exemples. La méthode présentée ici est spécialement conçue pour l’analyse des lignages cellulaires bactérienne unique plutôt que des combinaisons de souches ou espèces. Le dispositif microfluidique démontré ici utilise une variante de la « machine à mère » design4, dans lequel les cellules croissent monofichier dans une tranchée de microfluidique avec une extrémité fermée et une extrémité ouverte ; Division et la croissance des cellules pousse les cellules de la progéniture et se détache de l’extrémité ouverte dans l’écoulement du fluide. En général, nos analyses se concentrent uniquement sur la cellule « mère » qui se limite à l’extrémité fermée de la tranchée. Nous considérons cette méthode comme une promotion au cours de la précédentes lumière axée sur la microscopie unicellulaire des techniques analytiques, telles que l’immobilisation de la cellule sur des tampons en gel d’agarose. B. subtilis est utilisé comme un modèle ici, la méthode est également applicable aux autres espèces de bactéries (Escherichia coli est un autre modèle commun ; certaines espèces avec des tailles de cellules différentes ou morphologies peuvent demander la fabrication de nouveaux dispositifs avec des dimensions différentes). L’utilisation de reporters fluorescentes pour marquer les cellules et de visualiser les changements dans l’expression des gènes nécessite l’utilisation d’espèces génétiquement docile ; Toutefois, les analyses de la croissance cellulaire et de morphologie sont possibles même sans marqueurs fluorescents.
Le présent protocole exclut du processus de fabrication du maître de silicium à l’aide de photolithographie, qui a été largement décrite ailleurs5; maîtres peuvent également être facilement externalisées par les installations de microfabrication. Il comprend le moulage d’un dispositif PDMS issu d’un master de silicium renforcée ; collage de l’appareil à un morceau de verre ; montage de l’entrée de la microfluidique et la plomberie de sortie, y comprises pincée vannes afin de permettre la commutation moyenne ; passivation de l’appareil, la préparation des cellules bactériennes et charger l’appareil avec des cellules bactériennes ; fixation de la plomberie pour le périphérique et équilibration des cellules ; et le chargement de l’appareil sur un microscope à fluorescence pour l’imagerie. Parce que beaucoup d’acquisition d’images différentes et traitement logiciel outils peuvent être utilisés pour visualiser et analyser les différentes données d’intérêt4,5, exemple image sont affichées, mais les méthodes de capture d’image ne sont pas inclus dans le présent protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole de microfluidique est flexible car bon nombre des étapes peuvent être modifiées afin d’optimiser son utilisation avec une espèce particulière ou un souche ou dans un but précis. En effet, dans ce protocole nous avons fait des modifications apportées à l’ original du concept « machine mère »4 pour optimiser son utilisation avec b. subtilis. Souvent, les tranchées où les cellules sont confinés constituent un élément de la monocouche, tandis que dans le prés…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le National Institutes of Health, sous GM018568. Ce protocole a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS appartient à l’Université Harvard. Merci beaucoup résultent de Thomas Norman et Nathan Lord pour leur travail dans la conception et la fabrication du gabarit principal utilisé pour les dispositifs des ici et dans la construction de la version originale de l’appareil. Aussi, nous remercions Johan Paulsson pour ses précieux conseils collaborative et remercier les membres de son laboratoire pour leurs conseils et améliorations continues pour appareils microfluidiques bactérienne.
Materials
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
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